Diskreetti malli

Diffuusioravintoaineita kuluttavan mikrobipesäkkeen kasvua kuvataan Matsuuran23 esittelemällä ristikkopohjaisella mallilla, jonka yksityiskohdat on esitetty kohdassa 3. Lyhyesti sanottuna tarkastelemme suorakulmaista ristikkoa, jossa on L x- ja L y-kohtia x- ja y-suunnassa. Varattujen solujen lukumäärää merkitään ν ja vastaavaa solutiheyttä ρ = ν/(L x L y ). Suorakulmaisen ristikon kussakin elementissä voi olla enintään yksi solu, mutta siihen voi mahtua mikä tahansa ei-negatiivinen kokonaislukumäärä ravinnehiukkasia riippumatta siitä, onko kyseisessä paikassa myös solu. Jokaisella aika-askeleella hiivasolut voivat absorboida samassa paikassa sijaitsevan ravintohiukkasen ja tuottaa yhden tytärsolun viereiseen paikkaan kardinaalisuunnassa, kun taas ravintohiukkaset voivat ottaa s askelta, jälleen kardinaalisuunnissa. Alkutilanteessa solut kylvetään ristikkoon määrätyn kuvion mukaisesti, kun taas ravintohiukkasia sijoitetaan tasaisesti satunnaisesti alueelle, jotta saadaan tietty keskimääräinen alkupitoisuus c0. Alueen rajoja käsitellään kiinteinä seinäminä, mikä vastaa kokeellista käyttäytymistä petrimaljassa. Tärkeää on, että tämän mallin tuottamat kuviot ovat seurausta pelkästään solujen ja ravinteiden välisestä vuorovaikutuksesta, joten kaikki mallin tuottamat epäyhtenäiset morfologiat voidaan katsoa johtuvan yksinomaan DLG:stä.

Charakteristiset DLG-morfologiat

Matsushita & Fujikawa12 käytti pesäkettä B. subtilis-soluja havainnollistamaan kolmea keskeistä ilmiötä, jotka johtuvat DLG:stä: (I) lyhyempien sivuhaarojen ”seulominen” pidempien sivuhaarojen avulla, (II) vierekkäisten pesäkkeiden välinen repulsio ja (III) ravinnelähteeseen suuntautuva kasvu (kuva 2). Näiden ominaisuuksien on aiemmin osoitettu johtuvan pelkästään DLG:stä käyttämällä samanlaista pesäkkeen kasvun ristikkopohjaista mallia kuin tässä käytetty malli30. Vahvistamme ensin, että edellä kuvattu diskreetti malli voi toistaa tämän käyttäytymisen, ennen kuin käytämme tätä mallia tuotettujen mallien kvantifiointiin.

Matsushitan & Fujikawan12 kokeelliset tulokset (ylärivi) ja vastaavat mallisimulaatiot (alarivi). Kuvassa ovat (a) suuremmat oksat, jotka seulovat pienempiä oksia ravinteesta (ilmiö I), (b) kaksi lähekkäin kylvettyä pesäkettä, jotka näyttävät hylkivän toisiaan (ilmiö II), ja (c) yksittäinen pesäke, joka kasvaa kohti petrimaljan oikealla puolella olevaa ravinnelähdettä (ilmiö III). Simulaatiot (d) seulontahaaroista, (e) kahdesta lähekkäin olevasta pesäkkeestä ja (f) kasvusta, jossa ravinne on oikealla puolella, on laskettu käyttämällä ristikkopohjaista mallia. Siemensolut on merkitty punaisella pisteellä. Simulaatiot laskettiin ristikoilla, joiden mitat ovat L x = L y = 200 ja parametrit s = 3 ja c0 = 1, mikä johtaa Δ:n arvoon, joka on samaa suuruusluokkaa kuin kokeissa. Kuvat 2(a), 2(b) ja 2(c) on painettu uudelleen teoksesta Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita ja Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, Elsevierin luvalla.

Solujen ja ravintoaineen vuorovaikutussuhde voidaan kvantifioida karkeasti vertailemalla näiden kahden suureen suhteellista leviämisnopeutta. Pesäkkeen kasvua mitataan laskemalla pesäkkeen pinta-alan keskimääräinen muutosnopeus Δ m ylhäältä katsottuna, jolla on samat yksiköt kuin diffuusiokyvyllä. Tämä suure lasketaan helposti kokeellisesta kuvasta tai simuloidusta datasta, kuten diskreetin mallin tuottamasta datasta. Ravinteen leviämisasteeksi Δ n otetaan glukoosin diffuusiokyky, koska sitä käytetään yleisesti ravinnelähteenä ja koska eri ravinteiden diffuusiokyvyt eroavat toisistaan vain vähän. Glukoosin diffuusiokyvyn vedessä tiedetään olevan noin \({D}_{0}=4.03\times {10}^{-2}\)mm2 min-1 kokeellisten havaintojen perusteella36. Glukoosin diffuusiokyky pienitiheyksisessä agargeelissä saadaan seuraavalla kaavalla:

jossa w on agarin painoprosentti37. Jos oletetaan, että w = 0,3 %, diffuusiokyky on 4,01 × 10-2 mm2 min-2, ja tätä arvoa käytetään tämän tutkimuksen loppuosassa. Diffuusiokyky muuttuu vain vähän agarin määrän mukaan, joten w:llä on vähäinen vaikutus tuloksiin. Näistä suureista lasketaan suhdeluku

joka antaa dimensiottoman mittarin suhteellisille leviämisnopeuksille. Pienillä Δ:n arvoilla ravinne diffundoituu nopeammalla aikaskaalalla kuin solujen kasvu, mikä tarkoittaa, että kaikki paikalliset vaihtelut ravinnepitoisuudessa haihtuvat vaikuttamatta pesäkkeen morfologiaan. Δ:n arvo 1 tai suurempi osoittaa, että solujen kasvu tapahtuu vähintään yhtä nopeasti kuin ravinteiden diffuusio, ja ravinnepitoisuuden paikalliset vaihtelut voivat vaikuttaa pesäkkeen morfologiaan. Kolmesta kokeellisesta kuvasta vain suunnatun kasvun kuvassa on riittävästi tietoa sekä mittakaavasta että ajasta Δ:n laskemiseksi. Tästä kuvasta havaitaan, että Δ ≈ 0,23. Asettamalla mallissa s = 3 ja c0 = 1 saadaan aikaan ratkaisuja, joissa Δ:n arvot ovat välillä 0,3 ja 0,5, mikä on samaa suuruusluokkaa kuin kokeelliset tulokset ja tarjoaa siten sopivan vertailun. Näitä parametrien arvoja käytetään tämän alaluvun loppuosassa. Kunkin kolmen tapauksen käyttäytymistä kvantifioidaan edelleen jäljempänä kuvattujen spatiaalisten indeksien avulla Binder et al.38:n lähestymistavan mukaisesti. Jokaisessa simulaatiossa käytetään ristikkoa, jonka mitat ovat L x = L y = 200, mikä on riittävän suuri tuottamaan piirteitä riittävällä resoluutiolla, mutta silti laskennallisesti tehokas.

Haarojen seulonnan (ilmiö I) tutkimiseksi ravinteet kylvetään tasaisesti satunnaisesti eri puolille toimialuetta ja yksi solu sijoitetaan ristikon keskelle. Simulaatiota ajetaan, kunnes solujen kokonaistiheys on 0,2, mitä havainnollistaa kuvassa 2 esitetty edustava pesäke. Tässä pesäkkeessä on suuria haaroja, jotka lähtevät alkuperäisen keskimmäisen solun kohdalta, ja niiden välissä on lyhyempiä haaroja, joita suuremmat haarat ovat suojelleet ravinteelta, ja se osoittaa huomattavaa epätasaista kasvua. Tämä vastaa Matsushita & Fujikawan12 havaitsemaa käyttäytymistä. Morfologia voidaan kvantifioida laskemalla ensin kuhunkin soluun kohdistuvat kulmat, jotka on mitattu vastapäivään jostakin vertailukulmasta, jonka alkupiste on massakeskipisteessä. Laskennat skaalataan tasaisesti satunnaisesti jakautuneiden solujen odotusarvoilla, ja epäyhtenäisen kasvun kulmaindeksi I θ määritellään skaalattujen laskentojen keskihajonnaksi, jolloin suuremmat I θ-arvot osoittavat suurempaa epäyhtenäistä kasvua. Kokeellisen kuvan indeksi on 0,18, kun taas simulaation indeksi on 0,2, mikä osoittaa, että nämä kaksi ovat hyvin samansuuntaisia.

Hylkivien pesäkkeiden tapauksessa (ilmiö II) ravinne sijoitetaan jälleen tasaisesti satunnaisesti koko alueelle. Kaksi siemenkennoa sijoitetaan pystysuoraan keskelle aluetta, kukin kahdeksasosa alueen leveydestä etäisyydelle keskipisteestä vaakasuunnassa niin, että kennojen välissä on neljännes alueen kokonaisleveydestä. Simulaatiota lasketaan, kunnes solujen kokonaistiheys on 0,2. Tyypillinen simulaatio on esitetty kuvassa 2, jossa näkyy Matsushita & Fujikawan12 havaitsema kahden pesäkkeen välinen ero. Torjutut pesäkkeet voidaan kvantifioida laskemalla solujen kokonaismäärä ν ja kahden siemensolun väliin jäävien solujen ν c määrä simulaation lopussa. Tällöin repulsioindeksi määritellään seuraavasti: I c = 1 – ν c /ν, joka on lähellä 0,5, kun kaksi pesäkettä kasvavat tasaisesti, pienempi kuin 0,5, kun muodostuu kuilu, ja suurempi kuin 0,5, kun pesäkkeet kasvavat mieluummin toisiaan kohti. Kunkin pesäkkeen siemensolujen sijainnit kokeellisessa kuvassa approksimoidaan piirtämällä viivoja haaroja pitkin ja tunnistamalla, missä nämä leikkaavat toisensa. Kokeellisen kuvan ja simulaation indeksit ovat 0,19 ja 0,27, mikä viittaa siihen, että molemmat tuottavat samankaltaisia kasvumalleja, joissa kahden pesäkkeen välillä on merkittävä kuilu.

Suuntautunutta kasvua (ilmiö III) simuloidaan sijoittamalla aluksi kaikki ravintoaineet domainin oikeanpuoleisimpaan pylvääseen ja sijoittamalla yksi solu domainin keskelle. Tämän jälkeen simulointia lasketaan, kunnes solutiheys saavuttaa arvon 0,1. Kuvassa 2 on esitetty tyypillinen pesäke, joka muistuttaa läheisesti Matsushita & Fujikawan12 kokeellista tulosta. Jotta voidaan mitata suuntautumista alueen toiselle puolelle, lasketaan alueen oikealla puolella olevien solujen osuus I b suhteessa solujen kokonaismäärään siten, että I b ∈ . Indeksin I b arvot lähellä 0,5 merkitsevät vähäistä harhaa, kun taas I b < 0,5 merkitsee harhaa oikealle puolelle ja I b < 0,5 merkitsee harhaa vasemmalle puolelle. Kokeellisen kuvan indeksi on 0,92, mikä vastaa hyvin simulaatioindeksiä 0,93. Molemmissa tapauksissa indeksit viittaavat suureen kasvuvinoumaan kohti alkuperäistä ravinnepaikkaa.

Kuten Ginovart et al.30 havaitsivat, kokeellisten kuvien ja simulaatioiden hyvä laadullinen vastaavuus osoittaa, että DLG yksinään voi saada aikaan B. subtilis -pesäkkeiden seulomisen, hylkimisen ja suunnatun kasvun. Olemme vahvistaneet tätä vertailua entisestään käyttämällä kokeiden ja matemaattisen mallin välistä kvantitatiivista vertailua. Odotamme siis näiden ilmiöiden esiintyvän, kun DLG vaikuttaa morfologiaan, kun taas näiden ominaisuuksien puuttuminen viittaa siihen, että muut mekanismit ovat vastuussa kasvumallista. Ratkaisevaa on, että diskreetin mallin ja Ginovart et al. ehdottaman mallin välinen yksimielisyys osoittaa, että tässä käytetty diskreetti malli antaa tyydyttävän kuvauksen DLG:stä ja että sitä voidaan näin ollen käyttää tämän käyttäytymisen kvantifiointiin.

DLG:n indusoiminen

Näytettyämme, että diskreetti malli kykenee jäljittelemään DLG:n käyttäytymistä, kvantifioimme tässä yhteydessä näiden ilmiöiden riippuvuutta mallin parametreista, jotta voimme ennustaa, milloin DLG:n vaikutuksia ilmenee. Siirtokuntia simuloidaan jälleen ristikolla, jonka mitat ovat L x = L y = 200, käyttäen samoja kolmea alkuehtoa ja pysäytyskriteereitä kuin edellisessä alaluvussa. Simulaatiot toistetaan 50 kertaa kullekin ravinnevaiheparille s = 1, 5, …, 37 ja alkupitoisuuksille c0 = 1, 2, …, 7. Kullekin parametriparille lasketaan vastaava keskimääräinen indeksi 50 realisaation ajalta.

Tarkastellaksemme haarakarsintaa (ilmiö I) tarkastelemme yhdestä solusta yhdenmukaisessa ravinnekentässä kasvaneita pesäkkeitä, joita vastaavat indeksin keskiarvot \({\bar{I}}}_{\theta }\) 50 realisaation ajalta esitetään kuvassa 3. Suurimmat \({\bar{I}}}_{\theta }\) arvot syntyvät, kun sekä s että c0 ovat pieniä, mikä johtuu kahdesta tekijästä. Ensinnäkin, koska ravinteiden diffuusiokyky, käytännössä s, on pieni suhteessa solujen kasvunopeuteen, ravinnetasojen vaihtelut kehittyvät koko alueella. Toiseksi alhainen ravinteiden alkupitoisuus c0 tarkoittaa, että nämä vaihtelut luovat alueita, joilla ravinnetaso on liian alhainen tukemaan solujen kasvua. Kun joko s tai c0 on suurempi, ainakin toinen näistä olosuhteista ei voi toteutua, ja \({\bar{I}}}_{\theta }\) arvo pienenee, mikä osoittaa, että DLG:llä ei enää ole merkittävää vaikutusta pesäkkeeseen. Nämä tulokset osoittavat siis, että epäyhtenäisiä kuvioita voi esiintyä vain silloin, kun sekä ravinteiden diffuusiokyky suhteessa solujen kasvunopeuteen että ravinnepitoisuus ovat pieniä.

Mittaukset DLG:n vaikutuksista simuloiduissa mikrobipesäkkeissä. Kaikki simulaatiot on laskettu ristikkopohjaisella mallilla käyttäen erilaisia ravinneportaita s ja ravinteiden alkupitoisuuksia c0. Kuvassa on (a) keskimääräinen indeksi \({\bar{I}}}_{\theta }\) haarojen seulonnalle (ilmiö I), (b) keskimääräinen indeksi \({\bar{I}}_{c}\) pesäkkeiden karkottamiselle (ilmiö II) ja (c) keskimääräinen indeksi \({\bar{I}}_{b}\) suunnatulle kasvulle (ilmiö III).

Samankaltaista käyttäytymistä havaitaan hylkivän tapauksen (ilmiö II) osalta, kuten kuvassa 3 piirretystä keskimääräisestä indeksistä \({\bar{I}}}_{c}\) nähdään. Indeksin suurimmat arvot löytyvät s:n ja c0:n pienillä arvoilla, mikä tapahtuu samoista syistä kuin \({\bar{I}}}_{\theta }\) tapauksessa.

Käyttäytyminen suunnatun kasvun (ilmiö III) tapauksessa on erilaista, kuten nähdään kuvassa 3 esitetystä keskimääräisestä indeksistä \({\bar{I}}}_{b}\). Pienillä s:n arvoilla indeksi \({\bar{I}}}_{b}\) on suuri ja vaihtelee vähän c0:n mukaan. Kun s kasvaa, \({\bar{I}}}_{b}\) pienenee ja osoittaa suurempaa riippuvuutta c0:sta, ja \({\bar{I}}_{b}\) saa suurempia arvoja pienemmällä c0:lla. Parametrin arvojen vaihteluväli, jolla suunnattua kasvua voidaan havaita, on paljon suurempi kuin kahdessa muussa DLG-ilmiössä. Jos suunnattua kasvua ei tapahdu, ei tapahdu myöskään kahta muuta piirrettä, ja näin ollen suunnattu kasvu on hyödyllinen ensimmäinen DLG:n tarkistus, joka on helppo mitata. Tätä piirrettä käytetään DLG:n testaamiseen koko lopputyön ajan.

Kontinuumimalli

DLG-ilmiöiden syntyminen riippuu sekä ravinnepitoisuudesta että kahden lajin diffuusiokyvystä. Vaikka indeksit mittaavat näiden ilmiöiden riippuvuutta diskreettien ravinnevaiheiden määrästä s ja ravinteiden alkupitoisuudesta c0, Δ:n arvo voitiin laskea vain simuloidusta datasta eikä sitä voitu määrittää mallin syötteenä. Kokeellisia tietoja tarkasteltaessa on kuitenkin luonnollista luonnehtia solujen ja ravinteiden suhteellista leviämistä Δ:n avulla, koska se voidaan mitata helposti kokeellisista kuvista. Tässä esitellään deterministinen reaktio-diffuusioyhtälöiden järjestelmä, joka mallintaa solutiheyttä ja ravinnepitoisuutta ja mahdollistaa kummankin suureen suhteellisen diffuusion määrittelyn, mikä vastaa Δ:n asettamista. Vaikka tämä malli ei sovellu kuvassa 2 havaittujen hienojakoisten piirteiden kuvaamiseen, se pystyy toistamaan suunnatun kasvun kohti ravinnelähdettä (ilmiö III), jonka havaittiin ilmenevän suurimmalla parametrin vaihteluvälillä. Siksi keskitymme tähän DLG:n näkökohtaan, joka toimii helposti mitattavana merkkinä siitä, että DLG:tä tapahtuu.

Harkitsemme yksiulotteista aluetta, joka riittää havainnollistamaan mallin yleistä käyttäytymistä29,32,39. Kun käytetään kohdassa 3 kuvattua dimensiotonta sijaintia x, aikaa t, solutiheyttä n(x,t) ja ravinnepitoisuutta g(x,t), vallitsevat yhtälöt redusoituvat muotoon

jossa N voidaan tulkita dimensiottomaksi ravinnepitoisuudeksi. Yleisen käyttäytymisen havainnollistamiseksi on kuvassa 4 esitetty alkuehdot N = 1:lle.

Tulokset yksiulotteisesta reaktiodiffuusiomallista. (a) Alkutilanteessa N = 1 solut ovat keskittyneet alueen keskelle ja ravinne on oikealla. (b) I b:n maksimiarvot ajanhetkeen t = 1 asti, jotka on piirretty D:n ja N:n logaritmin base 10:n suhteen, viittaavat siihen, että DLG:tä esiintyy vain tietyillä parametriarvoilla. Kaksi edustavaa esimerkkiä on merkitty. (c) I b:n suurimmalla arvolla, kun D = 10-6 ja N = 1, solut ovat edelleen lähes symmetrisiä x = 0:n suhteen, kun taas ravinnepitoisuudesta on tullut käytännössä tasainen. (d) Käyttämällä D = 10-0,5 ja N = 105 saadaan aikaan merkittävä vinoutuma oikealle puolelle, jossa ravinne oli alun perin konsentroitunut.

Kun otetaan kohdassa 3 esitetyt tyypilliset parametriarvot kiinteiksi, N:n arvo vaihtelee vain fysikaalisesta ravinnepitoisuudesta johtuen. Kun tarkastellaan vain ravinteita sisältävää väliaineita, jotka edustavat enimmäispitoisuutta, havaitaan, että N:n arvo ei voi olla suurempi kuin noin 105 prosenttia. Ratkaisut lasketaan näin ollen arvolle 1 ≤ N ≤ 105. Vaikka tyypilliset kokeelliset havainnot viittaavat siihen, että 10-3 ≤ D ≤10-1, tarkastelemme arvoja 10-6 ≤ D ≤103, jotta voimme tutkia teoreettisesti, miten käyttäytyminen muuttuu D:n myötä. Näiden parametrien eri arvoille laskemme I b:n enimmäisarvon, joka on havaittu ajanhetkeen t = 1 asti. Tämä vastaa noin 119 kasvupäivää, joka on suurempi kuin tyypilliset kokeelliset ajat, mutta varmistaa, että I b:n enimmäisarvo havaitaan simulaation aikana. Lasketut indeksit I b on esitetty kuvassa 4 käyttäen molemmilla akseleilla logaritmista asteikkoa 10. Jos log(N) < 1, solujen kasvussa on vain vähän tai ei lainkaan harhaa I b:llä mitattuna. Suuremmilla N:n arvoilla havaitun vinoutuman määrä riippuu D:n arvosta, ja maksimi on lähellä (D,N) = (1, 105). Tämä D:n arvo vastaa samansuuruisia solujen ja ravinteiden diffuusioita, ja tämän arvon ympärillä on mahdollista havaita kasvuhäiriöitä niinkin pienillä N:n arvoilla kuin 101,5. Tyypillisissä koeolosuhteissa N on suuruusluokkaa 2, mikä osoittaa, että DLG-vaikutuksia havaitaan todennäköisimmin, kun D on lähellä ykköstä.

Käyttäytymisen vaihteluväliä havainnollistetaan edelleen tarkastelemalla kahden vastakkaisen esimerkin jakaumia. Kummassakin tapauksessa ratkaisu on esitetty ajankohtana, joka vastaa suurinta soluvinoumaa. Kuvassa 4 esitetyssä tapauksessa D = 10-6 ja N = 1 ravinnepitoisuus on muuttunut käytännössä tasaiseksi, ennen kuin solutiheys voi kehittyä selvästi oikealle puolelle, jonne ravinne oli aluksi keskittynyt. Sitä vastoin, kun otetaan D = 10-0,5 ja N = 105, jotka on myös esitetty kuvassa 4, solut osoittavat selvää mieltymystä alueen oikealle puolelle.

Jatkuvuusmallin analyysi viittaa siihen, että jos \(D\ll 1\), suunnattua kasvua ja siten DLG-vaikutuksia esiintyy vain N:n arvoilla, jotka ovat vähintään yhtä suuria kuin 103. Koska arviot osoittavat, että N on suuruusluokkaa 2, tämä viittaa siihen, että DLG:tä havaitaan vain, kun D on lähellä yksikköä, kuten kuvasta 4 käy ilmi. Tätä voidaan havainnollistaa myös fysikaalisten parametrien avulla. Käyttämällä kohdassa 3 annettuja parametriarvoja mikrobit, joiden diffuusiokyky on \({D}_{m}=3\times {10}^{-2}\)mm2 min-1 ja jotka on sijoitettu ympäristöön, jossa ravinteiden alkupitoisuus on maksimissaan \({N}_{0}\mathrm{=3.8}\times {10}^{-3}\)g mm-2, vastaisivat suunnilleen dimensiottomia arvoja D=0.75 ja N=104. Kuvan 4 perusteella olisi odotettavissa, että tämä laji kasvaisi kohti ravinnelähdettä ja käyttäytyisi siten DLG-käyttäytymisen mukaisesti. Jos samat mikrobit sijoitettaisiin ympäristöön, jonka suurin ravinnepitoisuus on \({N}_{0}\mathrm{=3.8}\times {10}^{-6}\)g mm-2, N:n arvo putoaisi arvoon 10 eikä yksipuolista kasvua enää havaittaisi. Tämän jakson tulokset tarjoavat siten kehyksen, jonka avulla voidaan tunnistaa, milloin DLG:n odotetaan esiintyvän vain D:n ja N:n estimaattien perusteella.

Kokeelliset vertailut

Malliennusteiden tarkastelun jälkeen käytämme niitä nyt tunnistamaan hallitsevan kasvumekanismin mikrobipesäkkeissä. Tarkastelemme kolmea kuvassa 1 esitettyä edustavaa kokeellista esimerkkiä: kahta B. subtilis -bakteerin pesäkettä ja yhtä S. cerevisiae -pesäkettä. Koska emme tiedä sopivaa arvoa diffuusiosuhteelle D, jota reaktio-diffuusiomalli edellyttää, kasvua luonnehditaan sen sijaan suhteellisella leviämisellä Δ (2). Tämä parametri edustaa pesäkkeen pinta-alan keskimääräisen muutosnopeuden suhdetta glukoosin diffuusiokykyyn ylhäältä katsottuna, ja se voidaan mitata kuvista. Koska ravinne on tasaisesti jakautunut ja vain yhtä pesäkettä kasvatetaan, mahdollisen DLG:n odotetaan näissä esimerkeissä ilmenevän epäsäännöllisenä kasvuna, johon liittyy haarakarsintaa (ilmiö I).

Kasvunopeuksien Δ m lasketut arvot on esitetty taulukossa 1 yhdessä vastaavien suhteellisten nopeuksien Δ kanssa. Nämä arvot osoittavat, että B. subtilis -pesäkkeet kasvavat kaksi suuruusluokkaa nopeammin kuin hiivapesäke ja yhtä suuruusluokkaa hitaammin kuin glukoosin diffuusiokyky. Käyttämällä tyypillisiä arvoja ravinteiden alkupitoisuudelle voidaan päätellä, että kokeet vastaavat N:n arvoa, joka on suuruusluokkaa 2. Tämän arvion ja Δ:n arvojen sovittaminen kuvasta 4 saatuihin mallituloksiin osoittaa, että B. subtilis vastaa järjestelmää, jossa tapahtuu DLG:n aiheuttamaa suunnattua kasvua. Koska tämä arvio tehtiin mittaamalla solujen lisääntymisnopeus p S. cerevisiae -pesäkkeessä, joka on todennäköisesti pienempi kuin vastaava arvo bakteereille, tämän arvion odotetaan olevan aliarvio N:lle, ja suurempi N-arvo lisää DLG:n havaitsemisen todennäköisyyttä. Sitä vastoin S. cerevisiae -pesäkkeessä Δ on suuruusluokkaa -3, mikä osoittaa, että ravinne diffundoituu paljon nopeammin kuin solujen kasvu. Tämän seurauksena ravinnepitoisuuden paikallisten vaihteluiden odotetaan haihtuvan ennen kuin ne vaikuttavat pesäkkeen morfologiaan. Tämä osoittaa, että DLG ei vaikuta morfologiaan. Vaikka bakteeri- ja hiivapesäkkeiden muodot muistuttavat voimakkaasti toisiaan vähäravinteisissa ympäristöissä, nämä kaksi morfologiaa johtuvat eri ilmiöistä. Bakteeripesäkkeet kasvavat niin nopeasti, että ravinteiden diffuusio saattaa rajoittaa kasvua, mikä johtaa epäsäännölliseen kuvioon. Hiivapesäkkeiden paljon hitaampi kasvu tarkoittaa, että DLG:tä ei voi esiintyä, ja sen sijaan vähäravinteisissa ympäristöissä syntyvien epäyhtenäisten pesäkemorfologioiden täytyy johtua pelkästään pseudohyfaalisesta kasvusta.

Etsimme lisävahvistusta näille tuloksille testaamalla suunnattua kasvua (ilmiö III) S. cerevisiae -pesäkkeissä jäljittelemällä Matsushita & Fujikawan12 ja simulaatioissa40 käyttämää asetelmaa. Petrimalja täytettiin synteettisellä matala-ammoniumdekstroosilla (SLAD), ja ravinne sijoitettiin petrimaljan keskelle. Hiivasolut kylvettiin eri etäisyyksille keskuksesta ja kuvattiin 16 päivän kasvun jälkeen. Muita kokeellisia yksityiskohtia esitetään kohdassa 3. Sekä glukoosia että ammoniumsulfaattia käytettiin rajoitettuna ravinteena, ja kuvassa 5 esitetään edustavat kuvat kummastakin. Kuvat on suunnattu siten, että petrimaljan keskipiste, johon ravinne oli sijoitettu, on oikealla puolella. Ammoniumin diffuusiokyky vedessä on noin 9,84 × 10-2 mm2 min-1 41. Koska tämä on samaa suuruusluokkaa kuin glukoosin diffuusiokyky, kummankin ravinnelähteen odotetaan johtavan samankaltaiseen Δ:n arvoon. Kummassakaan pesäkkeessä ei ole havaittavissa havaittavaa harhaa kasvussa mihinkään suuntaan, ja molempien harhaindeksit I b ovat lähes täsmälleen 0,5. Taulukossa 2 esitetään kunkin kokeen efektiiviset diffusiviteetit Δ m ja dimensiottomat diffusiviteetit Δ. Molemmissa tapauksissa Δ on suuruusluokkaa -3, mikä osoittaa, että suunnattua kasvua ei pitäisi havaita, ja vastaa aiempien kokeiden tuloksia.

Kuvia suunnatun kasvun kokeista, joissa käytettiin S. cerevisiaea. Kuvat on suunnattu siten, että vastaava ravinne on pesäkkeen oikealla puolella, kuten pystyteksti osoittaa. Pesäkkeitä kasvatettiin (a) SLAD-G:llä, johon lisättiin glukoosia oikealle, ja (b) SLAD-N:llä, johon lisättiin ammoniumsulfaattia oikealle. Mittakaavapalkit edustavat 5 mm.

Lisäistä näyttöä kasvutilasta antaa käyttäytyminen pesäkkeiden reunan lähellä. SLAD-N:llä kasvatetun pesäkkeen reunalla on selviä merkkejä epäyhtenäisestä kasvusta, mutta ei SLAD-G:llä kasvatetussa pesäkkeessä. Jos tämä kuvio johtuisi DLG:stä, odottaisimme samanlaista käyttäytymistä molemmilla väliaineilla. Tiedetään kuitenkin, että diploidiset hiivat, kuten tässä kokeessa käytetty AWRI796-kanta, siirtyvät pseudohyfaattiseen kasvuun, kun ne eivät saa typpeä2 , kuten SLAD-N:ssä. Tämä viittaa siihen, että hiivapesäkkeissä havaittu epätasainen kasvu, kuten kuvassa 1 on esitetty, johtuu pseudohyfaalisesta kasvusta eikä DLG:stä.