TOIMINNAN JOHDANTO

Jogurtti on maitotuote, joka valmistetaan fermentoimalla maitoa Lactobacillus spp:n kanssa. Nykyään jogurtin terapeuttiset, ennaltaehkäisevät ja ravitsemukselliset ominaisuudet hyväksytään laajalti (Boor, 2001). Kun probiootteja annetaan riittävässä määrin, ne antavat terveyshyötyjä isännälle ja lisäävät mikrobitasapainoa (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Probiootit ovat siis eläviä, ei-patogeenisiä, ystävällisiä mikro-organismeja, joilla on hyödyllisiä tehtäviä isännän mikrofloorassa (Schrezenmeir ja de Vrese, 2001). Maitohappobakteerit (LAB) ovat tärkein probioottisten mikro-organismien ryhmä, erityisesti Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. ja Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Maitotuotteen ravitsemukselliset ja terapeuttiset ominaisuudet määräytyvät probioottisten mikro-organismien mukaan (Boor, 2001).

Jogurtti on potentiaalinen probioottisten Lactobacillus spp:n lähde. Jogurtti tunnetaan myös rikkaimpana probioottisena saastuttavana elintarvikkeena. Maitotuotteen ravintoarvoa lisäävät käymisen seurauksena syntyvät probioottiset mikro-organismit ja aineenvaihduntatuotteet. Säännöllinen jogurtin saanti vähentää liiallista rasvaa maksasta ja parantaa eritystä. Se on tarpeen myös niille, jotka kärsivät sydänsairauksista, ateroskleroosista, verenpaineesta ja tulehduksista. Jogurtin vaikutuksesta erittyvä mahamehu johtaa korkeaan ruoansulatuskykyyn. Probioottisten mikro-organismien hyödyllinen vaikutus erityisesti Lactobacillus sp., joka on olemassa maitotuotteissa, jotka todisteet raportoitu lisäksi monet tutkijat tutkivat probioottisten mikro-organismien vaikutuksia patogeenisiä organismeja vastaan eri menetelmällä (Mercenier et al., 2003).

Laktobasillit ovat maitohappobakteereihin kuuluvia bakteereja, joiden ensisijainen käymisen lopputuote on maitohappo. Ne ovat kaupallisesti tärkeitä bakteereja, joilla on monenlaisia käyttökohteita sekä elintarviketeollisuudessa että muussa kuin elintarviketeollisuudessa niiden GRAS-statuksen (Generally Recognized As Safe) ansiosta. Laktobasillien molekyylibiologiaa on tutkittu laajasti niiden erityisten hyödyllisten ominaisuuksien parantamiseksi (Pouwels ja Leer, 1993).

Probioottien vaikutustapa perustuu probioottibakteerien kykyyn sitoa patogeenejä suoliston epiteelikudoksessa. Probioottien patogeenien vastainen vaikutus koostuu maitohapon tuotannosta, joka laskee pH:ta, on vuorovaikutuksessa patogeenien tuottamien toksiinien kanssa tuottamalla vetyperoksidia ja syntetisoimalla bakteeriosiinia (Corcionivoschi ym., 2010).

Tehokas probioottivalmiste edellyttää käytettävän bakteerilajin asianmukaista tunnistamista ja karakterisointia. Terapeuttisesti ja ravitsemuksellisesti hyödyllisten probioottisten organismien valinta perustuisi erityisominaisuuksiin (Fuller, 1989; Quewand ja Vesterlund, 2004).

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kerätä jogurttia Bangladeshin eri alueilta ja tunnistaa laktobasillit bakteriologisella sekä sukukohtaisella PCR:llä ja analysoida niiden probioottiset ominaisuudet sen jälkeen, kun patogeenisten bakteerien kasvua oli häiritty.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Näytteiden kerääminen ja maitohappobakteerien (LAB) eristäminen: Bangladeshin Chittagongin ja Bogran kaupungin eri supermyymälöistä kerättiin kahdenlaisia jogurttinäytteitä, jotka olivat maultaan happamia (näyte M1, M2 ja M3) ja makeita (näyte S2). Näytteet säilytettiin heti keräämisen jälkeen matalalämpöisessä (4 °C) jääkaapissa aseptisesti kontaminaation ja pilaantumisen estämiseksi. Lactobacillus spp. eristettiin jogurttinäytteistä asianmukaisilla laimennoksilla 0,9-prosenttisella suolaliuoksella. Organismin kasvattamiseen käytettiin MRS (Man, Rogosa ja Sharpe) -lientä ja MRS (Man, Rogosa ja Sharpe) -agarmediaa. Kasvualustojen pH säädettiin 6,5:een. Levyjä inkuboitiin aerobisesti 37 °C:ssa 48 tuntia. Lopuksi yksittäinen Lactobacillus-pesäke eristettiin tarkkailemalla pesäkkeiden morfologiaa ja joitakin biokemiallisia testejä, kuten gramvärjäystä, katalaasi- ja oksidaasitestiä. Hyvin eristetyt pesäkkeet poimittiin ja siirrettiin MRS-liemeen Lactobacillusten rikastamiseksi 37 °C:ssa.

Maitohappobakteerien (LAB) tunnistaminen bakteriologisen analyysin avulla: Tunnistaminen suoritettiin Bergeysin systeemisen bakteriologian käsikirjassa kuvattujen menetelmien mukaisesti. Ilman anaerobisia olosuhteita kaikki kannat kasvoivat hyvin MRS-agarilla 37 °C:ssa 48 tunnin ajan laktobasillien selektiivistä kasvua varten. Sopivista laimennoksista poimittiin yksi edustava pesäke, joka tunnistettiin alustavasti laktobasilleiksi Gram-värjäysreaktion, pesäkkeiden ulkonäön, solumorfologian, katalaasitestin, oksidaasitestin, indolitestin, metyylipunatestin, Voges-Proskauerin testin, sitraatin käyttötestin ja hiilihydraattien fermentaatiomallien perusteella Bergeysin käsikirjan (Hensyl, 1994) mukaisesti.

DNA:n uuttaminen isolaateista: DNA uutettiin neljästä jogurtista eristetystä näytteestä klassisen lämpösulatusmenetelmän mukaisesti (Salehi et al., 2005). Puhdas bakteeriviljelmä MRS-agar-liuskasta subkulturoitiin MRS-liemialustassa, josta otettiin 1,5 ml liemiviljelmää eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin 10 000 rpm 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen supernatantti hylättiin ja pelletti kerättiin. Pellettiin lisättiin noin 200 μL autoklavoitua deionisoitua vettä, joka liuotettiin sormella ravistelemalla. Eppendorf-putken korkki puhkaistiin steriilillä neulalla, minkä jälkeen putkea keitettiin vesihauteessa 100 °C:ssa 10 minuutin ajan. Heti keittämisen jälkeen eppendorf-putkea pidettiin jäässä 10 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin 10 000 rpm 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen kerättiin 100-150 μl supernatanttia, joka sisälsi bakteerien kromosomaalista DNA:ta.

Sukukohtainen PCR-monistus: Kaikkien neljän isolaatin sukuun kuulumisen määrittämiseksi suoritettiin PCR Lactobacillus-suvun spesifisillä alukkeilla LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) ja R16-1 (5′-CTTGTACACACACCCG CCCGTCA-3′), jotka oli suunniteltu Dubernet et al. (2002). PCR-analyysi tehtiin 16-23S ribosomaalisen RNA:n intergeenisen spacer-alueen perusteella aiemmin kuvatulla tavalla (Dubernet ym., 2002).

Reaktioseos (20 μl) sisälsi 1 μl (100 ng μL1) kutakin aluketta lisättynä 10 μl:lla 10× PCR Master Mix -seosta, 6 μl PCR-vesiä ja 2 μl templaattia. Ajo-olosuhteet olivat alku denaturointi 95 °C:ssa 5 minuutin ajan, jota seurasi 30 sykliä, jotka koostuivat denaturoinnista 95 °C:ssa 30 sekunnin ajan, hehkutuksesta 55 °C:ssa 30 sekunnin ajan, pidennyksestä 72 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja viimeisestä 7 minuutin pidennysvaiheesta 72 °C:ssa. Tuotteet säilytettiin 4 °C:ssa analyysiin asti. Monistetut tuotteet elektroforeesattiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä TAE-puskurissa (40 mM trisasetaattia, 1 mM EDTA, pH 8,2). Geelit värjättiin etidiumbromidilla (5 μg ml1) ja visualisoitiin UV-transiluminaattorissa (Biometra GmBH, Saksa).

Analyysi probioottiominaisuuksista: Probioottiominaisuudet määritettiin analysoimalla seuraavat testit.

NaCl-sietotesti: NaCl-toleranssin määrittämiseksi eristettyjä laktobasilleja kasvatettiin MRS-liemessä, joka sisälsi yhdeksän koeputkea, jotka oli säädetty eri NaCl-pitoisuuksilla (1-9 %). Autoklavoinnin jälkeen 15 minuutin ajan 15 Ibs:n paineessa 121 °C:ssa jokaiseen koeputkeen inokuloitiin 10 μl yön yli Lactobacillus-viljelmää ja inkuboitiin anaerobisesti 37 °C:ssa 24 tuntia. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen bakteerien kasvu mitattiin spektrofotometrillä 560 nm:ssä (Graciela ja Maruia, 2001).

Sappisuolan sietokykytesti: Bakteeriviljelmien kasvunopeus määritettiin MRS-liemessä, joka sisälsi eri määriä (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 ja 0,5 %) sappisuoloja. Tuoreet viljelmät inokuloitiin (1 %) väliaineeseen ja inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia anaerobisissa olosuhteissa. Tämän jälkeen kunkin näytteen optinen tiheys mitattiin spektrofotometrillä 560 nm:ssä (Graciela ja Maruia, 2001).

Kasvulle optimaalisen pH:n määrittäminen: Kasvun optimaalisen pH:n määrittämiseksi 100 μl tuoretta Lactobacillus yön yli -viljelmää inokuloitiin MRS-lientä sisältäviin koeputkiin, joiden pH vaihteli välillä 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ja 8,0. pH:n vaikutuksen määrittämiseksi kasvuun käytettiin asetaattipuskuria (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 5,5, 6, 6,5), Tris-HCl-puskuria (pH-7) ja boraattipuskuria (pH-8). Inokuloitua lientä inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa 24 tuntia 37 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen bakteerien kasvu mitattiin spektrofotometrillä 560 nm:ssä verrattuna inokuloimattomaan kontrolliliemeen.

Orgaanisen hapon kvantitointi ja pH-arvon määrittäminen: Hoque et al. (2010) mukaan suoritettiin isolaattien tuottamien orgaanisten happojen kvantifiointi ja niiden pH-arvojen määrittäminen. MRS-lientä, jota täydennettiin 10 % rasvattomalla maidolla, inokuloitiin 1 %:lla (v/v) tai 100 μl:lla isolaattien yön yli -viljelmää ja inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa 37 °C:n lämpötilassa 72 h. Fermentoituneet näytteet kerättiin joka 24., 48. ja 72. h:n välein, ja hyytyneen maidon nesteet erotettiin suodattamalla. Suodatuksen jälkeen erotetun nesteen pH kirjattiin digitaalisella elektrodi-pH-mittarilla ja orgaanisen hapon kvantifiointi tehtiin titraamalla 0,1 N NaOH:lla käyttäen pH-indikaattorina fenoftaaliineja (Hoque et al., 2010).

Patogeenisten bakteerien interferenssin seulonta: Eristettyjen Lactobacillus spp. antibakteerinen aktiivisuus eräitä patogeenisiä bakteereja vastaan määritettiin modifioidulla agar overlay -menetelmällä (Aween et al., 2012). Tässä tutkimuksessa käytettiin testipatogeeneina kahdeksaa erilaista ihmisen patogeeniä, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli ja Shigella sonnei. Antibakteerista aktiivisuutta luonnehdittiin edelleen määrittämällä, oliko se bakteriostaattinen vai bakterisidinen. Testi suoritettiin pyyhkäisemällä kasvunestovyöhyke. Pyyhkäisy levitettiin ravintoagarlevylle ja inkuboitiin aerobisesti 37 °C:ssa 72 h. Kasvun esiintyminen ravintoagarlevyllä tulkittiin inhiboivaksi aktiivisuudeksi eli bakteriostaattiseksi, kun taas kasvun puuttuminen tulkittiin bakterisidiseksi.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Bakteerien tunnistaminen bakteriologisten ja biokemiallisten testien avulla: Neljä isolaattia kasvatettiin Man, Rogosa ja Sharpe (MRS) -alustalla, jonka pH oli 6,5. Kaikki isolaatit olivat pieniä, epäsäännöllisen ja pyöreän muotoisia, kiiltävän valkean kerman- tai ruskehtavan värisiä, jotka olivat morfologisesti samankaltaisia kuin Lactobacillus spp.

Silloin kaikki isolaatit tutkittiin kirkkaalla kenttämikroskoopilla niiden mikroskooppisten ominaisuuksien havaitsemiseksi. Näiden isolaattien todettiin olevan grampositiivisia, lyhyitä ja keskikokoisia sauvamaisia, ei- itiöitä muodostavia bakteereja (kuvat 1a-d), mikä osoittaa niiden kuuluvan Lactobacillus spp:hen (Thamaraj ja Shah, 2003).

Lisäksi tehtiin joitakin biokemiallisia testejä, kuten katalaasi-, oksidaasi-, indoli-, metyylipuna- (MR-), Voges Proskauerin (VP-) testi, sitraatin käyttötesti ja hiilihydraattien fermentaatiomallit Bergeysin systemaattisen bakteriologian käsikirjan (Hensyl, 1994) määrittelemällä tavalla.

Isolaatit todettiin katalaasi- ja oksidaasinegatiivisiksi ja IMViC-testeissä (indoli-, metyylipuna-, Voges Proskauer- ja sitraatin hyödyntämistestit) kaikki isolaatit todettiin myös negatiivisiksi, jolloin nämä saattoivat vahvistaa, että isolaatit olivat Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al.,

Tässä tutkimuksessa kaikki neljä isolaattia pystyivät fermentoimaan 11 erilaista hiilihydraattia eli glukoosia, sakkaroosia, fruktoosia, laktoosia, ksyloosia, riboosia, galaktoosia, maltoosia, mannitolia, ramnoosia ja dekstroosia, mikä osoittaa, että ne pystyvät kasvamaan erilaisissa elinympäristöissä hyödyntäen erilaisia hiilihydraatteja. Kaikkien bakteriologisten ja biokemiallisten testien yhteenvetotulokset esitetään taulukossa 1. Kaikkien näiden tulosten on todettu olevan merkityksellisiä Chowdhury et al. (2012) havaintojen kannalta.

Molekyylitunnistus sukukohtaisen PCR:n avulla: Tässä tutkimuksessa käytimme sukukohtaista aluketta, joka oli valmistettu analysoimalla Lactobacilluksen 16- ja 23S-ribosomaalisen RNA:n geenien välisen 16S- ja 23S-ribosomaalisen RNA:n välisen spacer-alueen nukleotidisekvenssien samankaltaisuuksia (Dubernet et al., 2002). Tämän sukukohtaisen alukkeen spesifisyys yhdistettynä universaaliin alukkeeseen testattiin 23:lla eri alkuperää olevalla Lactobacillus-kannalla. PCR-tuotteet ajettiin geelielektroforeesin läpi 1-prosenttisessa agaroosissa ja visualisoitiin UV-transiluminaattorilla. Jokaisesta näytteestä (M1, M2, M3 ja S2) löytyi odotettu terävä 200 bp:n amplikonikaista, joka vastaa Lactobacillus spp. 16-23S rRNA:n intergeenistä spacer-aluetta (Dubernet et al., 2002). Näin ollen kaikki 4 isolaattia vahvistettiin suvun tasolla Lactobacillus spp:ksi. Negatiivinen kontrolli ilman templaattia ei antanut yhtään kaistaa, mikä viittaa siihen, että kaikki 4 PCR-tuotetta olivat templaatti-DNA:n vastaavuutta (kuva 2).

Probioottisten ominaisuuksien analysointi: Probioottiset bakteerit tuottavat erilaisia aineita, joilla on antibakteerisia ominaisuuksia, kuten orgaanisia happoja, H2O2:ta, bakteerien aineenvaihduntaan vaikuttavia bakteeri- ja toksiinituotteita (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

Tämä edellyttää, että ne kestävät suolistossa vallitsevia epäsuotuisia olosuhteita, kuten NaCl:ää ja sappisuolaa.

NaCl-sietotesti: Lactobacillus spp. -isolaatti, joka oli peräisin jogurtista, pystyi sietämään 1-9 % NaCl:ää. Isolaattien NaCl-toleranssin määrittämiseksi mitattiin optinen tiheys 560 nm:ssä ja tiedot piirrettiin. Isolaatit M1, M2, M3 ja S2 kasvoivat hyvin 1 prosentin NaCl-pitoisuudessa. Isolaattien M1, M2, M3 ja S2 maksimikasvu (OD) oli 1,420, 2,143, 1,662 ja 2,207 1 prosentin NaCl-pitoisuudessa (kuva 3). Korkea suolan sietokyky on toivottava ominaisuus probiootteina käytettäville organismeille.

Tiedetään, että NaCl on inhiboiva aine, joka voi estää tiettyjen bakteerityyppien kasvua. Tässä tutkimuksessa tulokset osoittivat, että jogurteista eristetyt Lactobacillus spp. sietivät 1-9 % NaCl:ää ja optimaalinen kasvu havaittiin 1-5 % NaCl:n kohdalla (Hoque et al., 2010).

Sappisuolan sietotesti: Eristetty Lactobacillus spp. pystyi selviytymään 0,05, 0,1, 0,15 ja 0,3 % sappihapossa. Eristetty Lactobacillus spp. pystyi myös lisääntymään edellä mainituissa sappihappopitoisuuksissa. Optinen tiheys mitattiin 560 nm:ssä ja tiedot piirrettiin. Kaikki isolaatit kasvavat hyvin 0,05 %:n sappisuolapitoisuudessa. Isolaattien M1, M2, M3 ja S2 suurin kasvu (OD) oli 1,741, 2,213, 1,758 ja 2,125. Kasvunopeus laski sappisuolakonsentraation kasvaessa (kuva 4).

Tässä kokeessa käytettiin 0,05-0,3 %:n sappikonsentraatiota, jota voi esiintyä ihmisen suolistossa, ja terveessä ihmisessä esiintyvän sapen maksimikonsentraatio on 0,3 % (Graciela ja Maruia, 2001). On raportoitu, että ennen kuin probioottinen bakteeri valitaan ihmisravinnoksi, sen on siedettävä 0,3 prosentin sappipitoisuutta (Gilliland et al., 1984). Tuloksen perusteella ehdotetaan, että nämä kannat voivat olla potentiaalisia käytettäväksi probioottisena organismina, koska kaikki isolaatit olivat vastustuskykyisiä ja pystyivät kasvamaan 0,3 %:n sappisuolapitoisuudessa.

Kasvun optimaalisen pH:n määrittäminen: Lactobacillus spp. pystyi kasvamaan pH-alueilla 4,0-8,0. Optinen tiheys mitattiin 560 nm:ssä ja tiedot piirrettiin. Isolaattien M1, M3 ja S2 suurin kasvu (OD) oli 2,201, 2,0619 ja 2,237 pH:ssa 6,0, kun taas isolaatin M2 suurin kasvu oli 2,259 pH:ssa 6,5 (kuva 5). Isolaatit pystyivät kasvamaan pH:n ollessa 4,0-8,0, mutta optimaalinen kasvu havaittiin pH:n ollessa 5,0-6,5, kun niitä kasvatettiin MRS-liemessä 37 °C:ssa. Tästä tutkimuksesta voidaan päätellä, että Lactobacillus spp:n kasvunopeus laskee tietyssä vaiheessa, kun pH-konsentraatio nousee (Chowdhury et al., 2012).

Organisen hapon kvantitatiivinen määritys ja pH-arvon määritys: Orgaanisen hapon kvantifiointiin käytettiin titrausmenetelmää.

orgaanisen hapon kvantifiointi = V×N×D

joissa V on NaOH:n tilavuus, N on NaOH:n vahvuus ja D on laimennuskerroin. Orgaanisen hapon tuotannon tulos on esitetty taulukossa 2.

Tutkimus osoittaa, että orgaanisen hapon tuotanto lisääntyi inkubaatioajan myötä, mutta samalla väliaineen pH laski happotuotannon lisääntyessä. Tuloksen (taulukko 2) perusteella Bogra-jogurtista eristetyn probioottisen Lactobacilluksen korkein happamuus (1,9 %) ja alhaisin pH 3,64 havaittiin 72 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa. Muiden Chittagongin eri supermarketeista eristettyjen probioottisten bakteerien happopitoisuus oli korkein (1,83, 2,11 ja 2,11 %) ja pH-arvo alhaisin (3,9, 3,68 ja 3,65) 72 tunnin inkubaation jälkeen.

Laktobasillien orgaanisen hapon tuotannossa on alueellisista eroavaisuuksista johtuvaa pientä variaatiota, joka viittaa siihen, että nämä isolaatit ovat lievästi riippuvaisia ilmaston ja ympäristön vaikutuksista (Hoque et al., 2010).

Patogeenisten bakteerien interferenssin seulonta: Probioottien, mukaan lukien Lactobacillus, Bifidobacterium ja Streptococcus spp., tiedetään estävän monenlaisten suolistopatogeenien kasvua ihmisessä. Suoliston mikroflooran epätasapainon aiheuttamien sairauksien torjuntaan liittyvien suotuisten vaikutusten lisäksi Dunne ym. (2001) ja Wollowski ym. (2001) raportoivat useista kokeellisista havainnoista, joiden mukaan bakteerit ehkäisevät paksusuolen kasvainten kehittymistä.

Tässä tutkimuksessa valitut neljä isolaattia tutkittiin niiden antibakteerisen aktiivisuuden perusteella erilaisia patogeenisiä bakteereja, kuten Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli ja Shigella sonnei, vastaan, jotka liittyvät elintarvikkeista aiheutuviin sairauksiin. Vertailu niiden inhibitiosta (millimetreinä) kahdeksaa testipatogeeniä vastaan on esitetty taulukossa 3.

Kokeelliset tulokset osoittivat, että isolaatti M1:n korkein inhibitorinen aktiivisuus osoitettiin Bacillus cereus -bakteeria vastaan (51,20±1,22 mm) ja alhaisin inhibitiovyöhyke oli (23,46±1,00 mm) Shigella sonnei -bakteeria vastaan 72 tunnin inkubaation jälkeen. Isolaatin M2 suurin inhibitiovyöhykkeen halkaisija oli E. coli -bakteeria vastaan (38,43±1,00 mm) ja pienin vyöhyke (20,10±1,00 mm) Bacillus megateriumia vastaan 72 tunnin inkubaation jälkeen. Vastaavasti isolaatti M3:n inhibitiovyöhykkeen halkaisija oli suurin P. aeruginosa -bakteeria vastaan (42,90±1,20 mm) ja pienin (17,83±1,10 mm) S. aureusta vastaan. Lopuksi isolaatissa S2 havaittiin suurin vyöhyke E. coli -bakteeria vastaan (43,80±1,20 mm) ja pienin vyöhyke (21,63±1,10 mm) S. aureusta vastaan 72 tunnin inkubaation jälkeen. Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae ja Escherichia coli -bakteereihin liittyvien tulosten todettiin vastaavan Chowdhury et al. (2012) havaintoja.

Tässä tutkimuksessa isolaatit M1, M2, M3 ja S2 osoittivat tyydyttäviä tuloksia bakteerien bakteereita tuhoavan ja bakteriostaattisen aktiivisuuden osalta. Isolaatti M1 oli bakterisidinen Bacillus megateriumille, Vibrio choleralle, Shigella sonnei:lle ja bakteriostaattinen Shigella dysenteriae:lle, Bacillus cereus:lle, P. aeruginosa:lle, S. aureukselle ja E. colille. Isolaatti M2 oli bakterisidinen Bacillus cereukselle, Shigella sonnei:lle ja bakteriostaattinen Shigella dysenteriae:lle, Pseudomonas aeruginosa:lle, Bacillus megateriumille, Staphylococcus aureus:lle, Vibrio cholerae:lle ja Escherichia coli:lle. Isolaatti M3 oli bakterisidinen Shigella dysenteriae:lle, Bacillus megateriumille ja Staphylococcus aureukselle ja bakteriostaattinen Bacillus cereukselle, Pseudomonas aeruginosalle ja Vibrio choleraelle, Escherichia coli ja Shigella sonnei, ja isolaatti S2 oli bakterisidinen Shigella dysenteriae:lle, Bacillus cereukselle, Pseudomonas aeruginosa:lle, Staphylococcus aureukselle, Vibrio cholerae:lle ja Shigella sonnei:lle ja bakteriostaattinen Bacillus megateriumille ja Escherichia coli:lle.

YHTEENVETO

Tässä tutkimuksessa Lactobacillus spp:n…, eristettiin ja tunnistettiin valikoiduista alueellisista jogurteista. Bakteerien tunnistamiseksi tehtiin useita bakteriologisia ja biokemiallisia testejä. Tämän lisäksi tehtiin PCR käyttäen Lactobacillus spp:n 16-23S rRNA:n intergeenistä spacer-aluetta vastaavia sukukohtaisia alukkeita (LbLMA-rev) ja universaalia aluketta (aluke R16-1) bakteriologisen tunnistuksen vahvistamiseksi. Eristetyt Lactobacillus spp. sietivät inhiboivia aineita, kuten NaCl:ää (1-9 %) ja sappisuolaa (0,05-0,3 %), ja ne pystyivät myös selviytymään emäksisissä olosuhteissa (pH 8,0). Kaikki nämä isolaatit (M1, M2, M3 ja S2) pystyivät hyödyntämään hiilihydraatteja, kuten glukoosia, ksyloosia, sakkaroosia, fruktoosia, galaktoosia, laktoosia, maltoosia, riboosia, ramnoosia, mannitolia ja dekstroosia. Lisäksi kaikista neljästä isolaatista (M1, M2, M3 ja S2) eristetty Lactobacillus spp. pystyi tuottamaan orgaanista happoa maidossa. Tämä tutkimus osoittaa, että Lactobacillusten orgaanisen hapon tuotannossa on vähäistä vaihtelua, joka johtuu niiden alueellisesta vaihtelusta. Kaikkien neljän isolaatin (M1, M2, M3 ja S2) antibakteerinen aktiivisuus kahdeksaa yleistä ihmisen patogeenistä bakteeria vastaan todettiin tyydyttäväksi, ja isolaatit tuottavat bakteeriosiinia solunulkoisesti. Probiootin on kyettävä estämään patogeenisiä organismeja, ja sen on siedettävä ihmisen suoliston vaikeita olosuhteita, kuten korkeaa suolapitoisuutta, matalaa pH:ta ja korkeaa sappisuolapitoisuutta. Kaikki eristetyt Lactobacillus spp. täyttivät nämä kriteerit, joten niitä voidaan pitää potentiaalisina probiootteina ihmisten terveyden kannalta.