Geneettisten transformaatiojärjestelmien luominen on mahdollistanut sen, että tiedemiehet ovat voineet transformoida vierasta DNA:ta filamenttisiin sieniin ja näin saada haluttuja kantoja teolliseen käyttöön. Nyt voimme hyödyntää täysimääräisesti sienten ylivoimaista erityskykyä ja niiden erinomaista tehokkuutta arvokkaiden aineenvaihduntatuotteiden valmistuksessa.

Protoplastivälitteinen transformaatio (PMT)

PMT on yleisimmin käytetty sienien transformaatiomenetelmä, joka perustuu suureen määrään kompetentteja sieniprotoplasteja. Periaatteena on käyttää joitakin kaupallisesti saatavilla olevia entsyymejä sienen monimutkaisten soluseinäkomponenttien poistamiseksi protoplastien tuottamiseksi. Tämän jälkeen käytetään joitakin kemiallisia reagensseja (kuten PEG:tä) edistämään eksogeenisten nukleiinihappojen ja protoplastien fuusioitumista, kuten jäljempänä tarkemmin kuvataan. Sienten soluseinän komponentit vaihtelevat suuresti eri kantojen välillä. Jopa itiökuoren komponentit eroavat merkittävästi saman kannan hyfojen kuoresta. Näin ollen ei ole olemassa yleispätevää muunnosmenetelmää, jota voitaisiin soveltaa eri sienikantoihin. Protoplastin valmistusta voidaan tuskin standardoida. Osa vaikeuksista johtuu rajallisesta tietämyksestämme soluseinän hydrolaaseista. Optimoidun PMT-menetelmän kehittäminen sienille vaatii vielä huomattavia ponnisteluja.

PMT on rutiininomaisesti käytetty muunnosmenetelmä. Menetelmää on jatkuvasti parannettu, jotta saavutettaisiin suurempi tehokkuus geneettisessä transformaatiossa ja sopivien geenilokusten kohdentamisessa geenieditoinnin avulla. Protoplastien valmistaminen edellyttää soluseinän poistamista, mikä tapahtuu pääasiassa entsyymikäsittelyllä. Protoplastien valmistuksessa on käytetty myös muita kuin entsyymimenetelmiä, kuten fysikaalisia menetelmiä, kuten jauhamista ja yliääniaaltoshokkia. Niitä ei kuitenkaan käytetä laajalti, koska ne ovat käytännössä hankalia ja protoplastien saanto on heikko. Taulukossa 1 on yhteenveto protoplastivälitteisistä transformaatioprotokollista eri sienilajeille.

PMT-menetelmän perusvaiheet

PMT-menetelmää sovellettiin ensimmäisenä Saccharomyces cerevisiaeen. Tutkijat valmistivat protoplastit kaupallisella etanaasilla ja käyttivät sorbitolia protoplastien säilömiseen. Myöhemmin tällaista menetelmää sovellettiin filamenttisiin sieniin, kuten Neurospora crassa , ja A. nidulans . Vaikka transformaatiomenetelmiä on parannettu, perusvaiheet ovat pysyneet pääosin samoina. PMT-menetelmän perusvaiheet on esitetty kuvassa 1.

Protoplastivälitteisen transformaation perusvaiheet

Protoplastien valmistus

Protoplastien valmistuksen ensimmäinen vaihe on soluseinän poistaminen entsymaattisen digestion avulla. Sienten soluseinämä koostuu glukaanista, mannaanista ja kitiinistä. Sienten soluseinän rakenne on erittäin dynaaminen, ja soluseinämä vaihtelee sienien solunjakautumisen ja kasvun aikana sekä itiöiden itämisessä, hyfojen haarautumisessa ja kalvon muodostumisessa. Soluseinän komponentit ovat myös erilaisia eri sienilajeissa, minkä vuoksi eri entsyymejä olisi käytettävä yhdessä. On raportoitu, että sopivan entsyymiseoksen valinta on avaintekijä protoplastien valmistuksessa .

Yleisesti ottaen hyfat ovat herkkiä sopivalle entsyymille, joka hydrolysoi sen soluseinää logaritmisessa vaiheessa. Neurosporan PMT-menetelmässä protoplastit valmistetaan hydrolysoimalla juuri syntyneitä hyfoja (viljely 4-6 tuntia 25-30 °C:ssa) . Vastaavasti protoplastit voidaan valmistaa myös konidiosporien avulla. Esimerkiksi Aspergillus- ja Penicillium-organismien osalta voidaan valita itiöemäisiä itiöitä tai oraita .

Protoplastit ovat herkkiä osmoottiselle paineelle, joten on huolehdittava vakaan osmoottisen paineen ylläpitämisestä, jotta protoplastit pysyisivät ehjinä soluseinien entsyymolyysin aikana. Näin ollen osmoottisia stabilisaattoreita (kuten sorbitolia, natriumkloridia ja kaliumkloridia) olisi sisällytettävä kaikkiin protoplastien valmistuksessa käytettäviin puskureihin solujen repeämisen välttämiseksi. Esimerkiksi sorbitoli-liuosta, jonka pitoisuus on 0,8-1,2 M, käytetään N. crassa-, Aspergillus sp. ja Trichoderma sp. -lajien protoplastien valmistuksessa protoplastien osmoottisen stabiliteetin ylläpitämiseksi. Taulukossa 2 on yhteenveto protoplastien valmistuksen parametreista eräille yleisimmille sienilajeille.

Exogeenisen DNA:n otto

Protoplastien suspensiossa käytettävä liuos sisältää tavallisesti kalsiumioneja ja osmoottisia stabilisaattoreita. Kalsiumin ajatellaan avaavan kanavia sytomembraanissa, mikä helpottaa eksogeenisen DNA:n pääsyä soluun, kun taas osmoottiset stabilointiaineet ovat välttämättömiä protoplastien morfologian ylläpitämiseksi. Yleensä tietty määrä polyetyleeniglykolia (PEG) lisätään yhdessä puhdistetun DNA:n kanssa (joka voi olla joko pyöreää kaksijuosteista DNA:ta tai linearisoitua DNA:ta). PEG on yleisesti käytetty solufuusion promoottori. Se voi muodostaa molekyylisillan solujen välille tai sytomembraanin ja DNA:n välille ja edistää siten adheesiota. Lisäksi se voi myös indusoida epäjärjestyneitä varauksia sytomembraanin pinnalle, muuttaa membraanin läpäisevyyttä ja helpottaa eksogeenisten nukleiinihappojen pääsyä soluihin.

PEG on ratkaiseva aine, joka parantaa transformaation tehokkuutta. Useimmissa tapauksissa heikkoa transformaatiotehokkuutta voidaan parantaa lisäämällä enemmän PEG:ää. Normaaliolosuhteissa pienimolekyylipainoisen PEG:n (kuten PEG3000) tehokkuus on parempi kuin suurimolekyylipainoisen PEG:n (kuten PEG8000). Tämä on kuitenkin optimoitava eri lajeille .

Transformaatiotehokkuuteen vaikuttaa myös lämpötila. Yleensä DNA:n ja protoplastien seos on asetettava jäähän 15-30 minuutiksi, jotta DNA voi tarttua protoplastien pintaan .

Protoplastien regeneraatio

Elinkelpoisten protoplastien hyvän palautumisen takaamiseksi protoplastien annetaan regeneroida levyllä ilman valintapainetta tietyn ajan ennen kuin ne siirretään selektiiviselle levylle. Osmoottisen stabilisaattorin olisi oltava mukana regenerointiviljelyssä. Vakaa osmoottinen paine on avaintekijä protoplastien soluseinän uusiutumiselle. Vain eksogeenisia nukleiinihappoja kantavat protoplastit voivat kasvaa selektiivialustalla.

Kommentteja PMT-menetelmästä

Protoplastien transformaatiomenetelmä on yksinkertainen ja tehokas, eikä siihen tarvita kalliita laitteita. Protokollaan kuuluu kuitenkin monia vaiheita ja kriittisiä reagensseja. Jokainen vaihe on optimoitava ja reagenssien laatu on testattava kriittisesti. Muunnettavien sienten kasvutilaa on seurattava huolellisesti. Kokemus on ratkaisevan tärkeää tämän menetelmän onnistuneen toteuttamisen kannalta.

Agrobacterium -välitteinen transformaatio (AMT)

Agrobacterium on gramnegatiivinen bakteeri, jota esiintyy yleisesti maaperässä. Agrobacterium tumefaciens voi tartuttaa loukkaantuneita kasveja. Kasvainta aiheuttava > 200 kb:n plasmidi, jota kutsutaan myös Ti-plasmidiksi, voitiin eristää infektion alkuvaiheessa. Kun A. tumefaciens infektoi kasvin, se tunkeutuu kasviin haavan kautta ja integroi osan Ti-plasmidista infektoituneiden kasvisolujen genomiin. Ti-plasmidin integroitunutta DNA-fragmenttia kutsutaan yleisesti transfer-DNA:ksi tai T-DNA:ksi. T-DNA asettuu kasvin genomiin satunnaisesti monokloonina. T-DNA:ta reunustaa kaksi suuntaa-antavaa epätäydellistä toistoa (ns. vasen ja oikea reuna), ja se sisältää geenejä, jotka koodaavat kasvaimen kasvua aiheuttavien kasvihormonien muodostumisesta vastaavia entsyymejä . Suunniteltiin binäärinen vektori, jossa kohdegeeni on sijoitettu vasemman ja oikean T-DNA:n rajojen väliin, ja rekombinanttiplasmidi transformoitiin Agrobacterium tumefaciens -bakteeriin. Positiivista Agrobacterium-kloonia käytettiin välineenä kohdegeenin integroimiseksi sienen genomiin. Yksittäisiä vaiheita käsitellään yksityiskohtaisesti jäljempänä.

AMT-menetelmä on osoittautunut vakaammaksi ja tehokkaammaksi kuin tavanomaiset transformaatiomenetelmät sen jälkeen, kun ensimmäisessä artikkelissa raportoitiin, että tätä menetelmää voitiin soveltaa sienien transformaatioon. AMT-menetelmää sovellettiin ensimmäisen kerran S. cerevisiaen muuntamiseen. Hygromysiiniresistenssigeeniä kantavaa plasmidia käytetään yleisesti Aspergillus awamorin muuntamiseen. AMT-menetelmää on sovellettu moniin ascomyceteihin, kuten Aspergillus , ja Monascus purpureus . AMT-menetelmän perusvaiheet esitetään kuvassa 2. Yhteenveto Agrobacterium-välitteisestä transformaatioprotokollasta eri sienilajeille on esitetty taulukossa 3.

Agrobakteerivälitteisen transformaation perusvaiheet

Tekijät, jotka vaikuttavat AMT:n tehokkuuteen

Monet tekijät vaikuttavat AMT:n tehokkuuteen, mukaan lukien lähtösienen materiaalin tyyppi (protoplasti, itiöemä, hyfa ja hedelmänrunkokudos), asetosyringonin pitoisuus, sienen ja Agrobacteriumin suhde ja yhteiskultivointiolosuhteet.

1. Lähtösienen materiaalin tyyppi AMT-menetelmässä voidaan käyttää sienien protoplasteja, itiöitä, hyfoja ja hedelmärunkokudosta. Eri kannoille on valittava sopivat lähtöaineet. Esimerkiksi AMT-menetelmä toimii vain Rhizopus. oryzae- ja Mucor circinelloides -sienien protoplasteilla, kun taas itiöt tai itiöemät eivät tuottaisi transformantteja .

2. Asetosyringonipitoisuus (AS) AS vaikuttaa kahdessa vaiheessa AMT-prosessin aikana. Toinen on induktioprosessi ja toinen on transformaatioprosessi. AS:ää käytetään yleensä indusoimaan T-DNA:n Vir-domeenin ilmentymistä, ja Vir-domeenissa oleva geeni aktivoi T-DNA:n siirron. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että transformaatioprosessin aikana tarvitaan asianmukainen määrä AS:ää. AS:n lisääminen ei kuitenkaan ole ehdottoman välttämätöntä Agrobacteriumin esiviljelyvaiheessa, mikä voi vähentää joidenkin kantojen muunnostehokkuutta. AS:n pitoisuus on tärkeä tekijä, joka vaikuttaa transformaatiotehokkuuteen sienen ja Agrobacteriumin yhteiskultivointiprosessin aikana Aspergillus awamorin AMT:ssä.

3. Sienten ja Agrobacteriumin suhde Tietyissä rajoissa transformaatiotehokkuus saavuttaa maksimitason sienen tai Agrobacteriumin määrän lisääntyessä. AMT:n optimaalinen suhde eri sienille on määritettävä empiirisesti. Sieni- ja bakteerisolujen suhde olisi optimoitava eri sieni-Agrobacterium-transformaatiojärjestelmiä varten.

4. Yhteiskulttuuriolosuhteet Yhteiskulttuuriolosuhteet ovat tärkeä tekijä AMT-menetelmässä. Niihin kuuluvat viljelyaika, lämpötila, pH ja suodattimen valinta. Lämpötila ja yhteenkasvatusaika ovat avaintekijöitä AMT-vaiheiden joukossa. Sieni-Agrobacterium-transformaatiossa sopiva aloitusolosuhde on 20-28 °C:n lämpötila ja rinnakkaiskasvatusaika 16-96 h. Alhaisempi lämpötila (20-25 °C) on yleensä edullinen AMT-menetelmän kannalta. Suodatin, joka on hydrofiilinen ja toimii alustana sienen ja Agrobacteriumin yhteiskultivoinnille, helpottaa yksittäisten pesäkkeiden siirtämistä seulontalevylle. Suodattimena voidaan käyttää nitroselluloosakalvoa, nailonkalvoa, suodatinpaperia, sellofaania ja polyvinyylideenifluoridikalvoa (PVDF).

Kommentteja Agrobacterium-välitteisestä transformaatiosta

Amt-menetelmä avaa uuden tien niille sienille, jotka eivät suostu transformaatioon tavanomaisilla menetelmillä. AMT-menetelmä soveltuu erityisen hyvin knock-in-mutaatioiden tuottamiseen sienissä, koska T-DNA asettuu genomiin satunnaisesti yhtenä kopiona. Lisäksi AMT-menetelmällä voidaan saavuttaa korkea homologisen rekombinaation tehokkuus erilaisissa geenien kohdentamiskokeissa.

AMT-menetelmän tärkeimpiä etuja ovat: ensinnäkin monipuoliset transformaation vastaanottajat, mukaan lukien protoplastit, hyfat ja itiöt; toiseksi kyky integroida eksogeenisia geenejä genomiin stabiilien transformanttien muodostamiseksi; ja kolmanneksi korkea transformaation tehokkuus, jonka tuloksena on suuri määrä transformantteja.

Amt-menetelmässä tarvitaan kaksoiskappaleita sisältäviä vektoreita, joiden valmistaminen on työlästä. Transformointiprosessin optimoinnissa on otettava huomioon useita tekijöitä. Tämä on AMT-menetelmän merkittävä rajoitus .

Elektroporaatiomuunnos

Elektroporaatio on yksinkertainen, nopea ja tehokas muunnosmenetelmä säikeisille sienille. Elektroporaatiossa sähkövaraukset varastoidaan kondensaattoriin korkeajännitteen muodostamiseksi, näytettä isketään impulssijännitteellä, ja eksogeeninen nukleiinihappo voidaan siirtää välittömästi soluihin. Yleensä sienien muuntamisessa käytetään neliöaaltoja tai eksponentiaalisia hajoamisaaltoja. Eksponentiaalisen hajoamisen pulssit luodaan yksinkertaisesti lataamalla ja purkamalla kondensaattori. Sähkökenttä pienenee eksponentiaalisesti huippuarvosta. Neliöaalto on ei-sinimuotoinen jaksollinen aaltomuoto (joka voidaan esittää sinimuotoisten aaltojen äärettömänä summana), jossa amplitudi vaihtelee tasaisella taajuudella kiinteän minimi- ja maksimiarvon välillä. Eri lajeille käytetään erilaisia elektroporaation aaltomuotoja. Taulukossa 4 on yhteenveto eri lajien elektroporaatiossa käytetyistä aaltomuodoista.

Kun solu altistetaan sähkökentälle, solukalvon rakenne muuttuu sytomembraanin välille indusoituvan jännitteen myötä. Sytomembraaniin voi muodostua mikrohuokosia sähköiskun jälkeen. Indusoitunut soluseinämän läpäisevyys on palautuva jännitteen ja keston raja-arvojen sisällä, muutoin se aiheuttaa peruuttamattomia vaurioita soluille. Siksi sytomembraanissa olevilla mikrohuokosilla näyttää olevan kaksi mallia sähköiskun jälkeen, palautuva ja palautumaton malli. Sytomembraanissa olevat lipidi- ja proteiinimolekyylit voivat palauttaa alkuperäisen rakenteen, kun käytetään sopivaa kentän voimakkuutta, kun taas irreversiibeli sähköshokki aiheuttaa korjaamattomuutta tai erittäin hidasta palautumista, mikä johtaa lopulta solukuolemaan . Ulkoista DNA:ta voidaan siirtää bakteeriin, kasvin protoplastiin, eläinsoluun ja säikeisiin sieniin elektroporaation avulla. Tätä menetelmää on sovellettu menestyksekkäästi useisiin sieniin. Ozeki et al. havaitsivat, että itiölliset itiöt soveltuvat paremmin muuntamiseen elektroporaation avulla. Viime vuosina elektroporaatiosta on tullut luotettava menetelmä joidenkin yleisten kantojen geenimuunnokseen. Yhteenveto elektroporaatiovälitteisistä transformaatioprotokollista eri sienilajeille on esitetty taulukossa 5.

Tekijät, jotka vaikuttavat elektroporaatiovälitteiseen transformaatioon

Elektroporaatioparametrit

1. Sähkön voimakkuus Sähkön voimakkuus on merkittävin elektroporaatiotehokkuuteen vaikuttava tekijä. Kun käytetyn sähkökentän intensiteetti saavuttaa suuruuden kV/cm ja pulssin leveys μs-ms asteikon, sytomembraani muuttuu ja soluseinämiin syntyy monia mikrohuokosia . Suuri sähkökentän voimakkuus liittyy eksogeenisten nukleiinihappojen suureen imeytymisnopeuteen ja alhaisempaan solujen eloonjäämisnopeuteen. Eri solutyypit vaativat kuitenkin erilaisia sähkökentän intensiteettejä sytomembraanikomponenttien eroista johtuen . Mikrohuokosia muodostuu vähän, kun sähkökentän voimakkuus ei ylitä vaadittua kynnysarvoa. Liian suuri sähkökentän voimakkuus sitä vastoin johtaa sytomembraanin peruuttamattomaan vaurioitumiseen, mikä johtaa solukuolemaan .

2. Kapasitanssi Elektroporaatioprosessin aikana sähkövarausten vaihtelu ja solususpensioon kohdistuva sähkökentän voimakkuus riippuvat kapasitanssista ja pulssin kestosta. Kapasitanssi vaikuttaa myös pulssin voimakkuuteen ja kestoon, joten suuremmalla kapasitanssilla on paremmat transformaatiovaikutukset .

3. Pulssin kesto ja taajuus Sytomembraanin rei’ityksen kestoon, joka liittyy suoraan elektroporaation transformaatiotehokkuuteen, vaikuttavat pulssin kesto ja taajuus .

Elektroporaatioympäristö ja ulkoiset tekijät

1. Puskuriliuos Puskuriliuos muodostaa tärkeän ympäristön solujen elektroporaatiolle, ja sähköshokkipuskuriliuoksen pH-arvolla on suuri merkitys. Tavallisesti käytetään puskuria, jonka pH on 7,0. Solut puhkeavat ja kuolevat helposti, jos pH on korkeampi kuin 7,0.

2. Lämpötila Elektroporaatioprosessin aikana syntyy suuri määrä lämpöä, joka vapautuu puskuriliuokseen. Siksi suositellaan alhaisempaa lämpötilaa (0-4 °C) paremman vaikutuksen aikaansaamiseksi . Lisäksi sähköiskua edeltävän seoksen kylvettäminen jäällä voi myös parantaa sähköiskun tehokkuutta.

3. Eksogeenisen nukleiinihapon konsentraatio Kaiken kaikkiaan elektroporaation tehokkuus kasvaa eksogeenisen nukleiinihapon konsentraation myötä. Kompakti superhelix-DNA pääsee helpommin soluihin sytomembraanin läpi. Vuonna 1995 eräässä tutkimuksessa raportoitiin, että 1 μg plasmidi-DNA:ta saattoi tuottaa 100 transformanttia A. nigerille .

Kommentteja elektroporaatiomenetelmästä

Elektroporaatiomenetelmää on sovellettu laajalti lukuisiin solutyyppeihin, mukaan lukien prokaryootit ja eukaryootit. Tällä tekniikalla on potentiaalia tulla valituksi menetelmäksi tutkimattomien sienilajien muuntamisessa. Verrattuna PMT-menetelmään, johon liittyy monimutkaisia vaiheita, elektroporaatio on yksinkertainen ja kätevämpi. Elektroporaation mekanismi on kuitenkin edelleen epäselvä. Sytomembraanin lävistysnopeus riippuu monista sähkökentän parametreista. Ja lisäksi se vaatii sopivat puskuriolosuhteet ollakseen optimaalisen tehokas.

Biolistinen transformaatio

Biolistinen transformaatio tunnetaan myös nimellä hiukkaspommitus. Sen periaatteena on, että vieras DNA adsorboituu volframi- tai kultahiukkasten pinnalle. Korkean paineen vaikutuksesta hiukkaset ruiskutetaan isäntäsoluihin. Hiukkaspommituksella voidaan toteuttaa sekä vakaa että ohimenevä transformaatio.

Vaihtelevat tekijät vaikuttavat pommituksen tehokkuuteen monimutkaisten vuorovaikutusten kuvioissa . Biologiset parametrit (solutyyppi, kasvuolosuhteet ja solutiheys) ja välineasetukset (hiukkastyyppi ja -koko, tyhjiö- ja painetaso, kohdeetäisyys) ovat tärkeitä muuttujia.

Hiukkaspommitus on tehokkain kaikista geneettisistä muunnosmenetelmistä. Se ei ole riippuvainen isännän tai lajin solutyyppien rajoituksista. Sienten osalta hiukkaspommitus on riittävän tehokas sellaisille organismeille, joita on vaikea viljellä tai joista on vaikea valmistaa protoplasteja. Hiukkaspommitus on helppo ja kätevä käyttää. Hiukkaspommituksessa käytettävät välineet ja tarvikkeet ovat kuitenkin kalliita. Sitä harkitaan vain silloin, kun muut menetelmät eivät toimi. Tällä hetkellä hiukkaspommitusta on käytetty menestyksekkäästi A. nidulansin ja T. reesei:n ym. muuntamiseen.

Shock-wave-mediated transformation (SWMT)

SWMT käyttää energian muuntamisen ja siirtämisen periaatetta tuottaakseen ohimenevän painehäiriön ja solujen välissä olevan vääntävän voiman ohimenevän kavitaatiovaikutuksen aikaansaamiseksi. Tätä menetelmää on sovellettu lääketieteellisessä hoidossa, kuten ortopediassa ja munuaiskivien murskaamisessa . SWMT muuttaa solukalvojen läpäisevyyttä akustisen kavitaation avulla, mikä johtaa eksogeenisen nukleiinihapon imeytymiseen soluihin. Menetelmää on käytetty menestyksekkäästi eksogeenisen nukleiinihapon syöttämiseen Escherichia coli-, Pseudomonas aeruginosa- ja Salmonella typhimurium -bakteereihin. Vuonna 2013 Denis Magaña-Ortíz et al. raportoivat ensimmäisen kerran SWMT:n soveltamisesta sieniin, mukaan lukien A. niger, Fusarium oxysporum ja Phanerochaete chrysosporium . Tässä artikkelissa todettiin kolme SWMT-menetelmän etua. Ensinnäkin tavanomaisiin transformaatiomenetelmiin verrattuna tällä menetelmällä voidaan vaikuttaa suoraan itiöihin, mutta ei protoplasteihin. Toiseksi fysikaaliset parametrit olivat helposti hallittavissa, ainoastaan itiöiden määrää, energiaa ja iskuaallon nopeutta oli säädettävä tarkasti. Kolmanneksi muunnoksen tehokkuus oli erinomainen. Denis Magaña-Ortízin ym. tulokset osoittivat, että Agrobacterium-transformaatiomenetelmään verrattuna SWMT-menetelmällä voitiin parantaa A. nigerin transformaatiotehokkuutta 5400-kertaiseksi.

Mutta tässä transformaatiomenetelmässä oli myös joitakin rajoituksia. Koska suuri osa DNA:sta vaurioituu iskuaaltokäsittelyssä, DNA:n ja solujen suhteen perusteella määritetty transformaatiotehokkuus oli melko alhainen . kuitenkin mukana olevien solujen määrän osalta transformaatiotehokkuus oli huomattavasti korkeampi . Tehokkuutta arvioitaessa on otettava huomioon kaksi näkökohtaa: DNA:n määrä ja solujen lukumäärä. Esimerkiksi Magana-Ortizin ja muiden tekemässä kokeessa protoplastien transformaatiossa ja elektroporaatiossa käytetty plasmidi-DNA on yleensä noin 1-10 μg . Näin suuren plasmidimäärän tuottaminen laboratoriossa SWMT-menetelmää varten on kallista ja hankalaa. Lisäksi iskuaaltolähteet ja -laitteet ovat kalliita, koska ne on suunniteltu ensisijaisesti lääketieteellisiin tarkoituksiin. Tämä osoittautuu suurimmaksi esteeksi menetelmän käyttöönotolle mikrobiologian laboratoriossa, jonka resurssit ovat rajalliset.