Tulokset ja keskustelu

Uutta AMHS-menetelmäämme helpottaa mehiläisten verenkiertoelimistön anatominen/toiminnallinen rakenne. Verenkierto pakotetaan sykkivällä supistumisella dorsaalisen ja ventraalisen pallean avulla, jotka pumppaavat hemolymfaa sydämeen. Seuraavaksi aortta kuljettaa hemolymfaa päähän (kuva 1F), joka toimittaa hemolymfaa mehiläisen aivoihin ja antenneihin.

Vertailtuna TCHS-menetelmään AMHS-menetelmällä voitiin kerätä 80-100 μl steriiliä hemolymfaa lyhyemmässä ajassa ja pienemmästä määrästä yksilöitä, mikä minimoi melanisaatioriskin. Uskomme, että hemolymfaa kerättäessä on tärkeää minimoida aika, jonka se on kosketuksissa ilman kanssa. Melanisaatioriski pienenee, kun keräysaika lyhenee ja jäähdytysvaiheeseen siirrytään nopeammin. Lyhyemmän keräysajan lisäksi hyönteisten käytön väheneminen on toinen AMHS-menetelmän merkittävä etu TCHS-menetelmään verrattuna. Mehiläistutkimukset olisi aina suunniteltava siten, että niiden mehiläisten määrä, joita on vahingoitettava, on mahdollisimman pieni. AMHS:n käyttö vaaditun hemolymfamäärän keräämiseen tarvittavien mehiläisten määrän vähentämiseksi on sopusoinnussa eläinten eettisempää käyttöä tutkimuksessa koskevien periaatteiden kanssa.

Tämänhetkiset tuloksemme osoittivat myös, että hyönteisten suurempi koko oli yhteydessä helpompaan ja nopeampaan hemolymfanäytteenottoon ja suurempaan kerättyyn hemolymfamäärään (taulukko 1). Hemolymfanäytteenotto Apis mellifera carnica- ja Apis cerana -työntekijöiltä kesti kauemmin ja vaati enemmän hyönteisiä kuin hemolymfanäytteenotto kimalaisilta, koska ensin mainitut lajit ovat huomattavasti pienempiä ja niillä on vähemmän hemolymfaa.

Hemolymfaa hankitaan tavallisimmin kapillaareista vaihtelevilla menetelmillä, esimerkiksi punktioimalla sydän, dorsaalinen tai ventraalinen rintakehän sivuontelon sivuontelo tai dorsaalinen aortta . Jokaiseen näistä menetelmistä liittyy riski, että kammio puhkaistaan, mikä johtaa näytteen kontaminaatioon suolen sisällön kanssa. Tällainen kontaminaatio tekee näytteestä käyttökelvottoman, ja lisäksi kapillaari on vaihdettava uuteen tai puhdistettava ja desinfioitava ennen seuraavaa käyttökertaa, mikä pidentää hemolymfan keräämiseen kuluvaa aikaa. Hemolymfan steriiliys voi vaarantua myös puhkaisemalla vatsasegmenttejä yhdistävän kalvon. AMHS:n käyttö poistaa nämä kapillaareihin liittyvät ongelmat. Lisäksi hemolymfan kerääminen dekapitaation avulla voi saastuttaa hemolymfan mehiläisen vatsasta vuotavalla nektarilla. Uudenlaisen AMHS-järjestelmän avulla saatiin biologisesti korkealaatuisia hemolymfanäytteitä. Hemosyytit näkyivät selvästi jokaisessa AMHS:llä otetussa hemolymfanäytteessä (kuva 1C). Jokaisen mikroskooppilevyn analyysi osoitti, että AMHS:llä saadut hemolymfanäytteet olivat puhtaita ja läpinäkyviä, eikä niissä ollut kontaminaatiota (esim. siitepölynjyviä).

Odotimme, että AMHS:n suorittamisessa etanolidesinfiointi ja hemolymfapisaran ja mehiläisen rungon välinen rajoitettu kosketus varmistaisi näytteen steriiliyden. Mikrobiologiset määritykset vahvistivat tämän odotuksen. AMHS:llä hankitun hemolymfan inkubointi sekä MRS- että Sabouraud-agar-alustoilla vahvisti hemolymfan steriiliyden. Mikro-organismien kasvua ei havaittu yhdessäkään 100 hemolymfapisarassa. Siksi tässä ei esitetä kvantitatiivisia tuloksia. Kun inkubaatioaika oli päättynyt, havaitsimme vain tummanruskeita melanoituneen hemolymfan ympyröitä jokaisen pisaran ympärillä. Tämä melanisaatio tapahtui inkubaatiojakson aikana, ei näytteenoton aikana (kuvat 1D ja 1E). Kun kerättyä hemolymfaa ei käytetä mikrobiologisiin testeihin, desinfiointivaihe voidaan jättää pois. On mahdollista, että antennien alueelle levitetty etanoli voi vaikuttaa entsyymi- tai hormonitoimintaan.

Muutkin tekijät kuin menetelmät voivat vaikuttaa hemolymfan keräämisen tehokkuuteen. Aiemmissa tutkimuksissamme havaitsimme, että mehiläisestä kerätyn hemolymfan määrä riippuu mehiläisen kastin ja iän lisäksi myös mehiläisen nesteytymisasteesta, joka mitataan ennen hemolymfanäytteenottoa nautitun nektarin tai sokerisiirapin määrän perusteella. Ptaszyńska et al. raportoivat, että asianmukaisen hemolymfamäärän ottaminen ei ole yhtä tehokasta vanhemmista mehiläisistä. Lisäksi näytteenoton tehokkuus voi riippua tutkijan laboratoriotaidoista. Näiden tekijöiden vuoksi on vaikeaa verrata eri hemolymfanäytteenottoprotokollien kvantitatiivisia ominaisuuksia eri laboratorioissa tehdyissä ja eri organismeja käyttävissä tutkimuksissa. Aiemmissa tutkimuksissamme olemme ottaneet hemolymfanäytteitä tuhansista mehiläisistä käyttäen AMHS-menetelmää sekä muita menetelmiä, kuten TCHS-menetelmää. Laboratoriomme henkilökunnalla on runsaasti kokemusta hemolymfan keräämisestä eri-ikäisiltä ja eri kasteihin kuuluvilta mehiläisiltä. Tämä kokemus auttoi meitä vertailemaan eri näytteenottomenetelmiä, sillä laboratoriohenkilöstön vaihtelevista taidoista johtuvat virheet eivät vaikuttaneet tuloksiimme. Tämänhetkiset tuloksemme osoittivat, että AMHS oli tehokas, puhdas ja erittäin tarkka menetelmä (taulukko 1), joka oli vähemmän aikaa vievä kuin TCHS .

Hemolymfanäytteenotto muilla menetelmillä kuin AMHS:llä vaatii yleensä lisälaitteita, kuten mikrokapillaariputkia. Lisäksi hemolymfan poistaminen mikrokapillaariputkista edellyttää joko erityisen pumpun käyttöä tai putkien murskaamista ja sentrifugointia helmien kanssa. Toinen AMHS-menetelmän etu on se, että yksittäisestä mehiläisestä kerätyn hemolymfatilavuuden mittaamiseen voidaan käyttää pipettivaakaa. Tämä on erityisen hyödyllistä, kun mikronäytteistä tehdään biokemiallisia analyysejä, esimerkiksi entsyymiaktiivisuuden määrittämiseksi. On syytä huomata, että muita menetelmiä kuin AMHS:ää käytettäessä puhdas hemolymfatilavuus voidaan laskea epäsuorasti perustuen putkessa ennen näytteenottoa olevaan hemolymfaveden tilavuuteen ja näytteenoton jälkeen mitattuun hemolymfaveden tilavuuteen. Tällainen menetelmä voi kuitenkin aiheuttaa lisävirheitä, minkä vuoksi jotkut tutkijat käyttävät Hamilton-ruiskuja . AMHS-menetelmällä vältetään Hamiltonin ruiskujen käytöstä aiheutuvat kustannukset ja lisätyö (esim. ruiskun puhdistaminen, desinfiointi jne.).

Mayackin ja Naugin menetelmä (hemolymfaa kerätään pyörittämällä mehiläisiä, joilla on leikattuja antenneja) on samankaltainen kuin AMHS-menetelmä. Heidän menetelmänsä vaatii kuitenkin sekä laboratoriosentrifugin että sen, että mehiläisten suuosat oli liimattava kiinni mahdollisen kontaminaation estämiseksi. Lisäksi heidän tutkimuksessaan mehiläisten suolet leikattiin Nosema ceranae -tartunnan arvioimiseksi ennen mehiläisten linkoamista. Ilman tätä vaihetta suolet olisivat todennäköisesti olleet kontaminaation lähde. Heidän menetelmänsä sisälsi mehiläisten sijoittamisen sentrifugiputkiin ja niiden pyörittämisen 16 000 RCF:n kierrosluvulla 30 sekunnin ajan hemolymfan saamiseksi. Tämä prosessi saattaa kerrostaa hemolymfakomponentit (esim. proteiinit ja hemosyytit), ja siihen liittyy lisääntynyt mikrobiologisen kontaminaation ja hemolymfan melanisaation riski (ks. edellä oleva keskustelu). Vaikka se voi olla ihanteellinen hemolymfan sokeripitoisuuksien analysoimiseksi niiden mehiläistarhaajien keskuudessa, joiden suolet on aiemmin poistettu (kuten heidän tutkimuksessaan), se ei ole täysin sopiva mikrobiologisiin ja geneettisiin tutkimuksiin tai entsyymiaktiivisuuden tutkimiseen. Tässä yhteydessä uusi AMHS-menetelmämme soveltuu paremmin yleiseen käyttöön, koska se on helppo ja yksinkertainen ja todennäköisesti sovellettavissa monenlaisiin erityyppisiin tutkimuksiin.