A genetikai transzformációs rendszerek létrehozása lehetővé tette a tudósok számára, hogy idegen DNS-t transzformáljanak fonalas gombákba, és így ipari célokra kívánt törzseket nyerjenek. Most már teljes mértékben kihasználhatjuk a gombák kiváló szekréciós képességét és kiváló hatékonyságukat az értékes metabolitok előállításában.

Protoplaszt-mediált transzformáció (PMT)

A PMT a leggyakrabban használt gombatranszformációs módszer, amely nagyszámú kompetens gombaprotoplasztra támaszkodik. Az elv az, hogy a protoplasztok előállításához néhány kereskedelmi forgalomban kapható enzimet használnak a gombák összetett sejtfal-komponenseinek eltávolítására. Ezt követően néhány kémiai reagens (például PEG) segítségével elősegítik az exogén nukleinsavak és a protoplasztok fúzióját, amint azt az alábbiakban részletesebben ismertetjük. A gombák sejtfalának összetevői a különböző törzsek között igen változatosak. Még a spóraköpeny komponensei is jelentősen eltérnek az ugyanabból a törzsből származó hifákéitól. Így nincs olyan univerzális transzformációs módszer, amely különböző gombatörzsekre alkalmazható lenne. A protoplasztok előállítása aligha szabványosítható. A nehézségek egy része a sejtfal-hidrolázok korlátozott ismeretéből ered. A gombák számára optimalizált PMT módszer kifejlesztése még mindig jelentős erőfeszítéseket igényel.

APMT egy rutinszerűen alkalmazott transzformációs módszer. A módszert folyamatosan fejlesztik, hogy nagyobb hatékonyságot érjenek el a genetikai transzformációban és a génszerkesztés révén a megfelelő génloci célba juttatásában. A protoplasztok előkészítése a sejtfal eltávolítását igényli, amit főként enzimes kezeléssel érnek el. A protoplasztok előállítására nem enzimes módszerekről is beszámoltak, például fizikai módszerekről, beleértve az őrlést és a szuperszonikus hullámsokkot . Ezeket azonban nem használják széles körben a gyakorlati kényelmetlenségek és a protoplasztok alacsony hozama miatt. A különböző gombafajok protoplaszt-mediált transzformációs protokolljainak összefoglalása az 1. táblázatban található.

A PMT módszer alapvető lépései

A PMT-t először a Saccharomyces cerevisiae esetében alkalmazták. A kutatók protoplasztokat készítettek a kereskedelmi forgalomban kapható csigaázzal, és szorbitot használtak a protoplasztok tartósítására. Később ilyen módszert alkalmaztak fonalas gombákra, mint például a Neurospora crassa , és az A. nidulans . Bár a transzformációs módszereket továbbfejlesztették, az alapvető lépések lényegében ugyanazok maradtak. A PMT-módszer alapvető lépéseit az 1. ábra mutatja be.

A protoplaszt-mediált transzformáció alapvető lépései

A protoplasztok előkészítése

A protoplasztok előkészítésének első lépése a sejtfal eltávolítása enzimes emésztéssel. A gombák sejtfalát glükán, mannán és kitin alkotja. A gombák sejtfalának szerkezete rendkívül dinamikus, és a sejtfal változik a gombák sejtosztódása és növekedése során, valamint a spórák csírázása, a hifák elágazása és a membrán kialakulása során. A különböző gombafajokban a sejtfal összetevői is eltérőek, ezért különböző enzimeket kell kombináltan használni. Arról számoltak be, hogy a megfelelő enzimkeverék kiválasztása kulcsfontosságú tényező a protoplasztkészítésben .

Általában a hifák érzékenyek a megfelelő enzimre, amely a logaritmikus fázisban hidrolizálja a sejtfalát. A Neurospora PMT eljárásában a protoplasztokat az újonnan született hifák hidrolízisével állítják elő (4-6 órás tenyésztés 25-30 °C-on) . Hasonlóképpen, a protoplasztok konídiumspórákból is előállíthatók. Például az Aspergillus és a Penicillium esetében választhatunk csíraspórákat vagy thalliokat .

A protoplasztok érzékenyek az ozmotikus nyomásra, ügyelni kell a stabil ozmotikus nyomás fenntartására, hogy a protoplasztok épek maradjanak a sejtfalak enzimolízise során. Ezért a sejtek megrepedésének elkerülése érdekében a protoplasztok előkészítéséhez használt összes pufferben ozmotikus stabilizátorokat (például szorbitot, nátrium-kloridot és kálium-kloridot) kell alkalmazni. Például 0,8-1,2 M koncentrációjú szorbitoldatot használnak a N. crassa , Aspergillus sp. és Trichoderma sp. protoplasztok előállításához a protoplasztok ozmotikus stabilitásának fenntartása érdekében. Néhány gyakori gombafaj protoplasztkészítési paramétereinek összefoglalása a 2. táblázatban található.

Az exogén DNS felvétele

A protoplasztok szuszpendálásához használt oldat általában kalciumionokat és ozmotikus stabilizátorokat tartalmaz. A kalcium feltehetően csatornákat nyit a citomembránban, ami megkönnyíti az exogén DNS bejutását a sejtbe, míg az ozmotikus stabilizátorok a protoplasztok morfológiájának fenntartásához szükségesek. Általában bizonyos mennyiségű polietilénglikolt (PEG) adnak a tisztított DNS-hez (amely lehet körkörös, kettős szálú DNS vagy linearizált DNS). A PEG egy általánosan használt sejtfúziós promóter. Képes molekuláris hidat képezni a sejtek között vagy a citomembrán és a DNS között, és így elősegíti az adhéziót. Ezenkívül rendezetlen töltéseket is előidézhet a citomembrán felszínén, megváltoztathatja a membrán permeabilitását, és megkönnyítheti az exogén nukleinsavak sejtekbe való bejutását .

A PEG a transzformáció hatékonyságát fokozó kulcsfontosságú szer. Az alacsony transzformációs hatékonyság a legtöbb esetben javítható több PEG hozzáadásával. Normál körülmények között az alacsony molekulatömegű PEG (mint a PEG3000) teljesítménye jobb, mint a nagy molekulatömegű PEG-é (mint a PEG8000). Ezt azonban különböző fajok esetében optimalizálni kell .

A transzformáció hatékonyságát a hőmérséklet is befolyásolja. Általában a DNS és a protoplasztok keverékét 15-30 percre jégre kell helyezni, hogy a DNS meg tudjon tapadni a protoplasztok felületén .

A protoplasztok regenerációja

Az életképes protoplasztok jó regenerálódásának biztosítása érdekében a protoplasztokat hagyjuk egy bizonyos ideig szelekciós nyomás nélkül a lemezen regenerálódni, mielőtt szelektív lemezre helyezzük őket. A regenerációs kultúrába ozmotikus stabilizátort kell tenni. A stabil ozmotikus nyomás a protoplasztok sejtfalának regenerálódásához kulcsfontosságú tényező. Csak az exogén nukleinsavakat hordozó protoplasztok nőhetnek a szelektív táptalajon.

Kommentárok a PMT módszerhez

A protoplaszt transzformációs módszer egyszerű és hatékony, nincs szükség drága berendezésekre. A protokoll azonban sok lépést és kritikus reagenseket tartalmaz. Minden egyes lépést optimalizálni kell, és a reagensek minőségét kritikusan tesztelni kell. A transzformálandó gombák növekedési állapotát gondosan nyomon kell követni. A módszer sikeres alkalmazásához elengedhetetlen a tapasztalat.

Agrobacterium -mediált transzformáció (AMT)

Az Agrobacterium egy Gram-negatív baktérium, amely általában a talajban található. Az Agrobacterium tumefaciens képes megfertőzni a sérült növényeket. A fertőzés korai szakaszában izolálni lehetett a 200 kb-os > 200 kb-os tumorindukáló plazmidot, amelyet Ti plazmidnak is neveznek. Amikor az A. tumefaciens megfertőz egy növényt, a seben keresztül jut be a növénybe, és a Ti plazmid egy részét integrálja a fertőzött növényi sejtek genomjába. A Ti-plazmid integrált DNS-töredékét általában transzfer DNS-nek vagy T-DNS-nek nevezik. A T-DNS véletlenszerűen, monoklónként épül be a növényi genomba. A T-DNS-t két irányított tökéletlen ismétlődés (az úgynevezett bal és jobb határ) szegélyezi, és olyan géneket tartalmaz, amelyek a növényi hormonok képződéséért felelős enzimeket kódolják, amelyek a tumor növekedését okozzák . Egy bináris vektort úgy terveztek, hogy a célgént a bal és a jobb T-DNS-határ közé illesztették be, és a rekombináns plazmidot az Agrobacterium tumefaciensbe transzformálták. A pozitív Agrobacterium klónt hordozóként használták a célgén integrálásához a gomba genomjába. A konkrét lépéseket az alábbiakban részletesen tárgyaljuk.

AzAMT módszer stabilabbnak és hatékonyabbnak bizonyult a hagyományos transzformációs módszereknél, mióta az első cikk beszámolt arról, hogy ez a módszer alkalmazható gombatranszformációra. Az AMT módszert először az S. cerevisiae transzformálására alkalmazták. Az Aspergillus awamori transzformálásához általában hígromicin-rezisztencia gént hordozó plazmidot használnak. Az AMT-módszert számos Ascomycetesre, köztük az Aspergillusra és a Monascus purpureusra is alkalmazták. Az AMT-módszer alapvető lépéseit a 2. ábra mutatja be. A különböző gombafajok Agrobacterium-mediált transzformációs protokolljának összefoglalása a 3. táblázatban található.

Az Agrobaktérium-mediált transzformáció alapvető lépései

Az AMT hatékonyságát befolyásoló tényezők

Az AMT hatékonyságát számos tényező befolyásolja, beleértve a kiindulási gombaanyag típusát (protoplaszt, spóra, hifa és termőtestszövet), az acetosziringon koncentrációját, a gomba és az Agrobacterium arányát, valamint az együttkultiválás feltételeit.

1. A kiindulási gombaanyag típusa Az AMT-módszer a gombák protoplasztjait, spóráit, hifáit és termőtestszövetét használhatja recipiensként. A különböző törzsekhez megfelelő kiindulási anyagokat kell kiválasztani. Például az AMT módszer csak a Rhizopus. oryzae és a Mucor circinelloides protoplasztjainál működik, míg a spórák vagy csíraspórák nem hoznának létre transzformánsokat .

2. Az acetosziringon (AS) koncentrációja Az AS két szakaszban hat az AMT folyamat során. Az egyik az indukciós folyamat, a másik pedig a transzformációs folyamat. Az AS-t általában a T-DNS Vir doménjének kifejeződésének indukálására használják, és a Vir doménben lévő gén aktiválja a T-DNS átvitelét. Számos tanulmány bizonyította, hogy a transzformációs folyamat során megfelelő mennyiségű AS-re volt szükség. Az AS hozzáadása azonban nem feltétlenül szükséges az Agrobacterium előkultivációs szakaszában, ami egyes törzsek esetében csökkentheti a transzformáció hatékonyságát. Az AS koncentrációja fontos tényező, amely befolyásolja a transzformációs hatékonyságot a gomba-Agrobaktérium ko-kultivációs folyamat során az Aspergillus awamori AMT-ben .

3. A gombák és az Agrobaktérium aránya Bizonyos határokon belül a transzformációs hatékonyság a gomba vagy az Agrobaktérium mennyiségének növelésével éri el a maximális szintet. Az AMT optimális arányát a különböző gombák esetében empirikusan kell meghatározni. A gombasejtek és a baktériumsejtek arányát a különböző gomba-Agrobaktérium transzformációs rendszerekhez optimalizálni kell.

4. Az együtttenyésztés feltételei Az együtttenyésztés feltételei fontos tényezőt jelentenek az AMT-módszerben. Ide tartozik a tenyésztési idő, a hőmérséklet, a pH és a szűrő kiválasztása. Az együtttenyésztés hőmérséklete és ideje a kulcstényező az AMT lépései között. A gomba-Agrobacterium transzformációban a megfelelő kiindulási feltétel a 20-28 °C-os hőmérséklet és a 16-96 órás együttkultiválási idő. Az AMT-módszer számára általában az alacsonyabb hőmérséklet (20-25 °C) előnyös. A szűrő, amely hidrofil, és a gomba-Agrobacterium együttkultúrázás hordozójaként szolgál, megkönnyíti az egyes telepek átvitelét a szűrőlemezre. Szűrőként nitrocellulózmembrán, nejlonmembrán, szűrőpapír, celofán és polivinilidén-fluorid (PVDF) membrán használható.

Kommentárok az Agrobacterium-mediált transzformációhoz

Az AMT módszer új utat nyit a hagyományos módszerekkel történő transzformációra visszahúzódó gombák számára. Az AMT módszer különösen alkalmas a gombák knock-in mutációinak létrehozására, mivel a T-DNS véletlenszerűen, egyetlen példányban épül be a genomba. Ezenkívül az AMT nagy homológ rekombinációs hatékonyságot érhet el a különböző géncélzási kísérletekben .

Az AMT-módszer főbb előnyei a következők: először is, változatos transzformációs recipiensek, beleértve a protoplasztokat, a hifákat és a spórákat; másodszor, az exogén gének integrálásának képessége a genomba, hogy stabil transzformánsok alakuljanak ki; és harmadszor, nagy transzformációs hatékonyság, ami nagy számú transzformánst eredményez .

Az AMT-módszer bináris vektorokat igényel, amelyek előállítása fáradságos. A transzformációs folyamat optimalizálásakor több tényezőt kell figyelembe venni. Ez az AMT módszer egyik fő korlátja .

Elektroporációs transzformáció

Az elektroporáció egyszerű, gyors és hatékony transzformációs módszer fonalas gombák esetében. Az elektroporáció során az elektromos töltéseket egy kondenzátorban tárolják, hogy nagyfeszültséget építsenek fel, a mintát megütik az impulzusfeszültséggel, és az exogén nukleinsav azonnal átvihető a sejtekbe. Általában négyszöghullámokat vagy exponenciális bomlási hullámokat használnak a gombák átalakításában . Az exponenciális lecsengésű impulzusokat egyszerűen egy kondenzátor töltésével és kisütésével hozzák létre. Az elektromos mező a csúcsértéktől exponenciálisan csökken. A négyszöghullám egy nem szinuszos periodikus hullámforma (amely szinuszos hullámok végtelen összegeként ábrázolható), amelyben az amplitúdó állandó frekvenciával váltakozik rögzített minimális és maximális értékek között. Az elektroporáció különböző hullámformáit különböző fajok esetében használják. A különböző fajok elektroporációjában használt hullámformák összefoglalása a 4. táblázatban található.

Amikor a sejtet elektromos térnek tesszük ki, a citomembrán szerkezete megváltozik a citomembrán között indukált feszültséggel. Az áramütés után a citomembránban mikropórusok alakulhatnak ki. Az indukált sejtfal áteresztőképesség a feszültség és az időtartam küszöbértékein belül reverzibilis, ellenkező esetben irreverzibilis sérülést okoz a sejtekben. Ezért a citomembránban lévő mikropórusok az elektrosokkot követően kétféle mintázatnak tűnnek, a reverzibilis és az irreverzibilis mintázatnak. A lipid- és fehérjemolekulák a citomembránban megfelelő térerősség alkalmazása esetén visszaállíthatják az eredeti szerkezetet, míg az irreverzibilis áramütés helyrehozhatatlanságot vagy rendkívül lassú helyreállítást eredményez, ami végül a sejtek halálához vezet . Az exogén DNS baktériumba, növényi protoplasztba, állati sejtbe és fonalas gombákba elektroporációval vihető át. Ezt a módszert sikeresen alkalmazták több gombánál. Ozeki és munkatársai felfedezték, hogy a csíra spórák jobban alkalmazhatók az elektroporációval történő transzformációra. Az utóbbi években az elektroporáció megbízható módszerré vált néhány gyakori törzs génátalakítására . A különböző gombafajok elektroporációval közvetített transzformációs protokolljainak összefoglalóját az 5. táblázat tartalmazza.

Az elektroporációs transzformációt befolyásoló tényezők

Elektroporációs paraméterek

1. Elektromos tér intenzitása Az elektromos tér intenzitása a legfontosabb tényező, amely befolyásolja az elektroporáció hatékonyságát. Amikor az alkalmazott elektromos tér intenzitása eléri a kV/cm nagyságrendet és az impulzus szélessége a μs-ms skálát, a citomembrán megváltozik és sok mikropórus keletkezik a sejtfalakon . A nagy elektromos térintenzitás az exogén nukleinsavak magas felvételi arányával és alacsonyabb sejttúlélési aránnyal jár. A különböző sejttípusok azonban különböző elektromos térerősséget igényelnek a citomembrán összetevőinek különbségei miatt . Kevés mikropórus képződik, ha az elektromos térerősség nem haladja meg a szükséges küszöbértéket. Ezzel szemben a túlzott elektromos térerősség a citomembrán irreverzibilis károsodását eredményezi, ami a sejtek elhalásához vezet .

2. Kapacitás Az elektroporációs folyamat során az elektromos töltések változása és a sejtszuszpenzióra alkalmazott elektromos térerősség a kapacitástól és az impulzus időtartamától függ. Az impulzus intenzitását és időtartamát a kapacitás is befolyásolja, ezért a nagyobb kapacitás jobb transzformációs hatást eredményez .

3. Impulzus időtartama és frekvenciája A citomembrán perforációjának időtartamát, amely közvetlenül kapcsolódik az elektroporáció transzformációs hatékonyságához, az impulzus időtartama és frekvenciája befolyásolja .

Elektroporációs környezet és külső tényezők

1. Pufferoldat A pufferoldat fontos környezetet biztosít a sejtek elektroporációjához, és az elektrosokk pufferoldat pH értéke nagy jelentőséggel bír. Általában 7,0 pH-értékű pufferoldatot használnak. A sejtek 7,0-nál magasabb pH-nál könnyen átszúródnak és elpusztulnak .

2. Hőmérséklet Az elektroporációs folyamat során nagy mennyiségű hő keletkezik, amely a pufferoldatba kerül. Ezért a jobb hatás érdekében csökkentett hőmérséklet (0-4 °C) ajánlott . Továbbá az elektrosokk előtti keverék jégfürdőzésével is javítható az elektrosokk hatékonysága.

3. Az exogén nukleinsav koncentrációja Összességében az exogén nukleinsav koncentrációjával nő az elektroporáció hatékonysága. A kompakt szuperhélix DNS könnyebben bejut a sejtekbe a citomembránon keresztül. 1995-ben egy tanulmány arról számolt be, hogy 1 μg plazmid DNS-sel 100 transzformánst lehet létrehozni A. niger esetében .

Kommentárok az elektroporációs módszerről

Az elektroporációs módszert széles körben alkalmazták számos sejttípuson, beleértve a prokariótákat és eukariótákat is. Ez a technológia alkalmas lehet arra, hogy a még fel nem tárt gombafajok transzformációjának módszerévé váljon. A PMT-módszerrel összehasonlítva, ahol bonyolult lépésekkel jár, az elektroporáció egyszerű és kényelmesebb. Az elektroporáció mechanizmusa azonban még mindig tisztázatlan. A citomembrán perforációs sebessége az elektromos mező számos paraméterétől függ. És emellett megfelelő pufferfeltételekre is szükség van ahhoz, hogy optimálisan hatékony legyen.

Bioelektromos transzformáció

A bioelektromos transzformációt részecskebombázás néven is ismerik. Elve az, hogy az idegen DNS-t volfrám- vagy aranyrészecskék felületén adszorbeálják. Nagy nyomás hatására a részecskéket a gazdasejtekbe juttatják. A részecskebombázás stabil és átmeneti átalakulást is megvalósíthat.

Változatos tényezők befolyásolják a bombázás hatékonyságát a komplex kölcsönhatások mintáiban . A biológiai paraméterek (sejttípus, növekedési feltétel és sejtsűrűség) és a műszeres beállítások (részecske típusa és mérete, vákuum és nyomásszint, céltávolság) fontos változók .

A részecskebombázás a leghatékonyabb az összes genetikai transzformációs módszer közül. Nincs kitéve a gazdaszervezet vagy faj sejttípusainak korlátainak. Gombák esetében a részecskebombázás kellően hatékony azon szervezetek esetében, amelyeket nehéz tenyészteni, vagy amelyekből nehéz protoplasztokat előállítani. A részecskebombázás könnyen és kényelmesen működtethető. A részecskebombázáshoz szükséges eszközök és fogyóeszközök azonban drágák. Csak abban az esetben jöhet szóba, ha más módszerek nem működnek. Jelenleg a részecskebombázást sikeresen alkalmazták az A. nidulans és a T. reesei stb. sikeres átalakítására.

Lökéshullám-mediált transzformáció (SWMT)

A SWMT az energia átalakításának és átvitelének elvét használja az átmeneti nyomászavar és csavaró erő létrehozására a sejteken keresztül, átmeneti kavitációs hatás kialakításához. Ezt a módszert az orvosi kezelésben, például az ortopédiában és a vesekövek zúzásában alkalmazták . Az SWMT akusztikus kavitáció révén megváltoztatja a sejtmembránok áteresztőképességét, ami az exogén nukleinsav felvételét eredményezi a sejtekbe. A módszert sikeresen alkalmazták exogén nukleinsav bejuttatására Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa és Salmonella typhimurium sejtekbe. Denis Magaña-Ortíz és munkatársai 2013-ban számoltak be először az SWMT alkalmazásáról gombák, köztük az A. niger, a Fusarium oxysporum és a Phanerochaete chrysosporium esetében . Ebben a cikkben az SWMT módszer három előnyére hívták fel a figyelmet. Először is, a hagyományos transzformációs módszerekhez képest ez a módszer képes közvetlenül a spórákra hatni, de nem a protoplasztokra. Másodszor, a fizikai paraméterek könnyen szabályozhatók voltak, csak a spórák számát, a lökéshullám energiáját és sebességét kellett pontosan szabályozni. Harmadszor, az átalakítás hatékonysága kiváló volt. Denis Magaña-Ortíz és munkatársai eredményei azt mutatták, hogy az Agrobacterium transzformációs módszerrel összehasonlítva az SWMT módszer az A. niger esetében 5400-szorosára tudta növelni a transzformáció hatékonyságát .

A transzformációs módszer néhány korlátja is figyelemre méltó volt azonban. Mivel a DNS nagy része károsodik a lökéshullámos kezelés során, a DNS és a sejtek aránya alapján meghatározott transzformációs hatékonyság meglehetősen alacsony volt . azonban az érintett sejtek számát tekintve a transzformációs hatékonyság jelentősen magasabb volt . A hatékonyság értékelésénél két szempontot kell figyelembe venni: a DNS mennyiségét és a sejtek számát. Például a Magana-Ortiz et al. által végzett kísérletben a protoplaszt transzformációhoz és az elektroporációhoz használt plazmid DNS általában 1-10 μg . Drága és kényelmetlen ilyen nagy mennyiségű plazmidot előállítani a laboratóriumban az SWMT módszerhez. Továbbá a lökéshullámforrások és műszerek drágák, mivel elsősorban orvosi célokra tervezték őket. Ez bizonyul a módszer korlátozott erőforrásokkal rendelkező mikrobiológiai laboratóriumokban történő alkalmazásának legfőbb akadályának.