INTRODUCTION

Le yaourt est un produit laitier préparé par la fermentation du lait avec Lactobacillus spp. De nos jours, les propriétés thérapeutiques, prophylactiques et nutritionnelles du yaourt sont largement acceptées (Boor, 2001). Lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, les probiotiques sont bénéfiques pour la santé de l’hôte et augmentent l’équilibre microbien (Fuller, 1989 ; Guarner et al., 2005). Les probiotiques sont donc des micro-organismes vivants, non pathogènes et amicaux qui jouent des rôles bénéfiques dans le compartiment de la microflore de l’hôte (Schrezenmeir et de Vrese, 2001). Les bactéries lactiques (LAB) constituent le groupe de microorganismes probiotiques le plus important, notamment les Lactobacillus sp., les Bifidobacterium sp. et les Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Les qualités diététiques et thérapeutiques du produit laitier sont déterminées par les microorganismes probiotiques (Boor, 2001).

Le yaourt est une source potentielle de probiotiques Lactobacillus spp. Le yaourt est également connu comme l’aliment contaminant le plus riche en probiotiques. La valeur nutritionnelle du produit laitier est augmentée par les micro-organismes probiotiques et les métabolites produits à la suite de la fermentation. La consommation régulière de yaourt permet de réduire l’excès de graisse dans le foie et d’en améliorer la sécrétion. Il est également nécessaire pour ceux qui souffrent de maladies cardiaques, d’athérosclérose, d’hypertension et d’inflammation. Le suc gastrique qui est sécrété par l’action du yaourt entraîne une grande capacité de digestion. L’effet bénéfique des micro-organismes probiotiques en particulier Lactobacillus sp, qui existe dans les produits laitiers qui preuve rapportée en outre, de nombreux chercheurs ont étudié les effets des micro-organismes probiotiques contre les organismes pathogènes en utilisant une méthode différente (Mercenier et al, 2003).

Lactobacilles sont des membres des bactéries lactiques dont le produit final de fermentation primaire est l’acide lactique. Ce sont des bactéries commercialement importantes avec une grande variété d’applications à la fois dans les industries alimentaires et non alimentaires en raison de leur statut « Generally Recognized As Safe » (GRAS). Les lactobacilles ont été largement étudiés pour leur biologie moléculaire afin d’améliorer leurs caractéristiques bénéfiques spécifiques (Pouwels et Leer, 1993).

Le mode d’action des probiotiques est basé sur la capacité des bactéries probiotiques à lier les agents pathogènes dans le tissu épithélial intestinal. L’action anti-pathogène des probiotiques consiste en la production d’acide lactique qui diminue le pH, interagit avec les toxines produites par les pathogènes avec la production de peroxyde d’hydrogène et la synthèse de bactériocine (Corcionivoschi et al., 2010).

Un produit probiotique efficace nécessite une identification et une caractérisation appropriées d’une espèce bactérienne utilisée. La sélection des organismes probiotiques qui peuvent être utiles sur le plan thérapeutique et nutritionnel serait basée sur des propriétés spécifiques (Fuller, 1989 ; Quewand et Vesterlund, 2004).

Le but de cette recherche était de collecter des yaourts de différentes régions du Bangladesh et l’identification des lactobacilles par PCR bactériologique ainsi que spécifique au genre et l’analyse de leurs propriétés probiotiques suite à l’interférence avec la croissance des bactéries pathogènes.

MATERIELS ET METHODES

Collecte d’échantillons et isolement des bactéries lactiques (LAB) : Deux types d’échantillons de yaourts ont été collectés dans différents supermarchés de la ville de Chittagong et Bogra au Bangladesh qui avaient un goût aigre (échantillon M1, M2 et M3) et doux (échantillon S2). Les échantillons ont été stockés immédiatement après leur prélèvement dans un réfrigérateur à basse température (4°C) de manière aseptique afin de les protéger de toute contamination ou détérioration. Le Lactobacillus spp. a été isolé des échantillons de yaourt par des dilutions appropriées avec une solution saline à 0,9%. Les milieux bouillon MRS (Man, Rogosa et Sharpe) et gélose MRS (Man, Rogosa et Sharpe) ont été utilisés pour la croissance de l’organisme. Le pH des milieux a été ajusté à 6,5. Les plaques ont été incubées en aérobiose à 37°C pendant 48 heures. Enfin, la colonie unique de Lactobacillus a été isolée en observant la morphologie de la colonie et certains tests biochimiques tels que la coloration de Gram, la catalase et l’oxydase. Les colonies bien isolées ont été prélevées et transférées dans un bouillon MRS pour l’enrichissement des Lactobacillus à 37°C.

Identification des bactéries lactiques (LAB) par analyse bactériologique : L’identification a été réalisée selon les méthodes décrites dans le manuel de bactériologie systémique de Bergeys. Sans l’utilisation de conditions anaérobies, toutes les souches ont bien poussé sur la gélose MRS à 37°C pendant 48 heures pour la croissance sélective des lactobacilles. A partir de dilutions appropriées, une colonie représentative a été prélevée et provisoirement identifiée comme lactobacilles après la réaction de coloration de Gram, l’apparence de la colonie, la morphologie cellulaire, le test de la catalase, le test de l’oxydase, le test de l’indole, le test du rouge de méthyle, le test de voges-proskauer, le test d’utilisation du citrate et les modèles de fermentation des hydrates de carbone comme délimité par le manuel de Bergeys (Hensyl, 1994).

Extraction de l’ADN des isolats : L’ADN a été extrait de 4 échantillons isolés du yaourt selon la méthode classique de chaleur-dégel (Salehi et al, 2005). La culture bactérienne pure provenant de la gélose MRS a été subculturée dans un milieu de bouillon MRS à partir duquel 1,5 ml de bouillon de culture a été prélevé dans un tube eppendorf et centrifugé à 10 000 rpm pendant 5 minutes. Après cela, le surnageant a été jeté et le culot a été collecté. Environ 200 μL d’eau désionisée autoclavée ont été ajoutés au culot et dissous par agitation avec les doigts. Le bouchon du tube eppendorf a été percé par une aiguille stérile, puis le tube a été bouilli au bain-marie à 100°C pendant 10 min. Juste après l’ébullition, le tube eppendorf a été maintenu dans la glace pendant 10 min, puis centrifugé à 10 000 rpm pendant 10 min. Ensuite, 100-150 μL de surnageant contenant l’ADN chromosomique bactérien ont été recueillis.

Amplification PCR spécifique au genre : Pour déterminer l’affiliation au niveau du genre de tous les 4 isolats, une PCR a été effectuée avec l’ensemble d’amorces spécifiques au genre Lactobacillus LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) et R16-1 (5′-CTTGTACACACCG CCCGTCA-3′) conçu par Dubernet et al. (2002). L’analyse PCR a été effectuée sur la base de la région intercalaire intergénique de l’ARN ribosomal 16-23S comme décrit précédemment (Dubernet et al., 2002).

Le mélange réactionnel (20 μL) contenait 1 μL (100 ng μL1) de chaque amorce ajoutée avec 10 μL de 10× PCR Master Mix, 6 μL d’eau PCR et 2 μL de matrice. La condition d’exécution était une dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, suivie de 30 cycles consistant en une dénaturation à 95°C pendant 30 sec, un recuit à 55°C pendant 30 sec, une extension à 72°C pendant 30 sec et une étape d’extension finale de 7 min à 72°C. Les produits ont été conservés à 4°C jusqu’à leur analyse. Les produits amplifiés ont été soumis à une électrophorèse sur des gels d’agarose à 1% dans du tampon TAE (acétate de Tris 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2). Les gels ont été colorés avec du bromure d’éthidium (5 μg mL1) et visualisés sous transilluminateur UV (Biometra GmBH, Allemagne).

Analyse des caractéristiques probiotiques : Les caractéristiques probiotiques ont été déterminées en analysant les tests suivants.

Test de tolérance au NaCl : Pour la détermination de la tolérance au NaCl, les Lactobacilles isolés ont été cultivés dans un bouillon MRS contenant neuf tubes à essai qui ont été ajustés avec différentes concentrations de NaCl (1-9%). Après autoclavage pendant 15 min sous une pression de 15 Ibs à 121°C, chaque tube à essai a été inoculé avec 10 μL de culture nocturne de Lactobacillus et incubé en anaérobiose à 37°C pendant 24 h. Après 24 h d’incubation, la croissance bactérienne a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 560 nm (Graciela et Maruia, 2001).

Test de tolérance aux sels biliaires : Le taux de croissance des cultures bactériennes a été déterminé dans un bouillon MRS contenant différents niveaux (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 et 0,5%) de sels biliaires. Des cultures fraîchement préparées ont été inoculées (1%) dans le milieu et incubées à 37°C pendant 24 h en condition anaérobie. Ensuite, la densité optique de chaque échantillon a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 560 nm (Graciela et Maruia, 2001).

Détermination du pH optimal pour la croissance : Pour la détermination du pH optimal pour la croissance, 100 μL de culture fraîche de Lactobacillus overnight ont été inoculés dans des tubes à essai contenant du bouillon MRS avec des pH variables allant de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 et 8,0. Pour déterminer l’effet du pH sur la croissance, on a utilisé le tampon acétate (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5), le tampon Tris-HCl (pH-7) et le tampon borate (pH-8). Le bouillon inoculé a été incubé en condition anaérobie pendant 24 heures à 37°C. Après incubation, la croissance des bactéries a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 560 nm par rapport au bouillon témoin non inoculé.

Quantification de l’acide organique et détermination de la valeur du pH : Selon Hoque et al. (2010), la quantification des acides organiques produits par les isolats et la détermination de leurs valeurs de pH ont été effectuées. Le bouillon MRS complété avec 10% de lait écrémé a été inoculé avec 1% (v/v) ou 100 μL de culture nocturne des isolats et incubé en condition anaérobie à 37°C pendant 72 h. Les échantillons fermentés ont été collectés toutes les 24, 48 et 72 h et les liquides du lait coagulé ont été séparés par filtration. Après filtration, le pH du liquide séparé a été enregistré à l’aide d’un pH-mètre à électrode numérique et la quantification de l’acide organique a été effectuée par titrage avec du NaOH 0,1 N en utilisant le phénophtalien comme indicateur de pH (Hoque et al., 2010).

Criblage de l’interférence avec les bactéries pathogènes : Les activités antibactériennes des Lactobacillus spp isolés, contre certaines bactéries pathogènes ont été déterminées par la méthode de superposition de gélose modifiée (Aween et al., 2012). Huit agents pathogènes humains différents, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli et Shigella sonnei ont été utilisés dans cette étude comme agents pathogènes à tester. L’activité antibactérienne a été caractérisée en déterminant si elle était bactériostatique ou bactéricide. Le test a été effectué par écouvillonnage de la zone d’inhibition de la croissance. L’écouvillon a été étalé sur une plaque de gélose nutritive et incubé en aérobiose à 37°C pendant 72 h. La présence de croissance dans la plaque de gélose nutritive a été interprétée comme une activité inhibitrice c’est-à-dire bactériostatique tandis que l’absence de croissance a été interprétée comme bactéricide.

RESULTATS ET DISCUSSION

Identification des bactéries par des tests bactériologiques et biochimiques : Les quatre isolats ont été cultivés dans le milieu Man, Rogosa et Sharpe (MRS) à pH 6,5. Tous les isolats ont été produits petits, irréguliers et de forme ronde avec une couleur blanchâtre brillante ou brunâtre qui étaient morphologiquement similaires à Lactobacillus spp.

Puis tous les isolats ont été examinés au microscope à fond clair pour observer leurs caractéristiques microscopiques. Ces isolats ont été trouvés gram positif, court et moyen bâtonnet en forme de bactérie non sporulée (Fig. 1a-d) qui les indiquent pour être membre de Lactobacillus spp. (Thamaraj et Shah, 2003).

En outre, certains tests biochimiques tels que le test de la catalase, le test de l’oxydase, le test de l’indole, le test du rouge méthyle (MR), le test de Voges Proskauer (VP), le test d’utilisation du citrate et les schémas de fermentation des glucides ont été réalisés comme délimité par le manuel de bactériologie systématique de Bergeys (Hensyl, 1994).

Les isolats ont été trouvés catalase et oxydase négative et dans les tests IMViC (indole, methyl-red, voges proskauar, citrate utilization) tous les isolats ont également été trouvés négatifs, ainsi ceux-ci pourraient confirmer les isolats étaient Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al…, 2010).

Dans cette étude, tous les quatre isolats ont été capables de fermenter 11 hydrates de carbone différents, à savoir, le glucose, le saccharose, le fructose, le lactose, le xylose, le ribose, le galactose, le maltose, le mannitol, le rhamnose et le dextrose indiquant qu’ils sont capables de se développer dans une variété d’habitats en utilisant différents types d’hydrates de carbone. Les résultats résumés de tous les tests bactériologiques et biochimiques sont présentés dans le tableau 1. Tous ces résultats sont jugés pertinents par rapport aux conclusions de Chowdhury et al. (2012).

Identification moléculaire par PCR spécifique au genre : Dans cette étude, nous avons utilisé une amorce spécifique au genre préparée en analysant les similitudes entre les séquences nucléotidiques de la région d’espacement entre les gènes de l’ARN ribosomal 16 et 23S de Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). La spécificité de cette amorce spécifique du genre combinée à une amorce universelle a été testée contre 23 souches de Lactobacillus d’origine variée. Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel dans de l’agarose à 1% et visualisés par transilluminateur UV. Une bande nette attendue d’un amplicon de 200 bp a été trouvée pour chaque échantillon (M1, M2, M3 et S2) qui correspond à la région de l’espaceur intergénique de l’ARNr 16-23S de Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Ainsi, tous les 4 isolats ont été confirmés au niveau du genre comme Lactobacillus spp. Le contrôle négatif sans matrice n’a donné aucune bande, ce qui suggère que tous les 4 produits PCR étaient la correspondance de l’ADN de la matrice (Fig. 2).

Analyse des caractéristiques probiotiques : Les bactéries probiotiques produisent une variété de substances ayant des propriétés antibactériennes, y compris l’acide organique, H2O2, les bactériocines qui affectent le métabolisme bactérien ou la production de toxines (Rafter, 2003 ; Rolfe, 2000 ; Vandenbergh, 1993).

Pour cela, ils doivent être capables de résister avec les conditions défavorables dans l’intestin comme le NaCl et le sel biliaire.

Test de tolérance au NaCl : L’isolat Lactobacillus spp, provenant de yaourts était capable de tolérer 1-9% de NaCl. Pour déterminer la tolérance au NaCl des isolats, la densité optique a été mesurée à 560 nm et les données ont été tracées. Les isolats M1, M2, M3 et S2 se sont bien développés dans une concentration de 1% de NaCl. La croissance maximale (DO) des isolats M1, M2, M3 et S2 a été trouvée à 1,420, 2,143, 1,662 et 2,207, respectivement, dans 1% de NaCl (Fig. 3). Une haute tolérance au sel est une propriété souhaitable pour les organismes à utiliser comme probiotiques.

Il est connu que le NaCl est une substance inhibitrice qui peut empêcher la croissance de certains types de bactéries. Dans cette étude, les résultats ont montré que les Lactobacillus spp, isolés des yaourts étaient capables de tolérer 1-9% de NaCl et une croissance optimale a été observée à 1-5% de NaCl (Hoque et al., 2010).

Test de tolérance aux sels biliaires : Lactobacillus spp isolé, a été capable de survivre dans 0,05, 0,1, 0,15 et 0,3% d’acide biliaire. Le Lactobacillus spp. isolé a également été capable de se multiplier dans les concentrations d’acide biliaire mentionnées ci-dessus. La densité optique a été mesurée à 560 nm et les données ont été tracées. Tous les isolats se développent bien dans une concentration de 0,05% de sel biliaire. Les croissances maximales (DO) des isolats M1, M2, M3 et S2 étaient respectivement de 1,741, 2,213, 1,758 et 2,125. Le taux de croissance a diminué avec l’augmentation du niveau de concentration des sels biliaires (Fig. 4).

Dans cette expérience, on a utilisé 0,05-0,3% de concentration de bile qui peut se trouver dans le tractus intestinal humain et la concentration maximale de bile qui est présente chez l’homme sain est de 0,3% (Graciela et Maruia, 2001). Il est signalé qu’avant de sélectionner une bactérie probiotique pour la consommation humaine, elle doit être tolérable à une concentration de bile de 0,3% (Gilliland et al., 1984). Sur la base du résultat, il est suggéré que, ces souches peuvent être potentielles pour une utilisation comme organisme probiotique parce que tous les isolats étaient résistants et capables de se développer dans une concentration de 0,3% de sel biliaire.

Détermination du pH optimal pour la croissance : Le Lactobacillus spp isolé, provenant des yaourts était capable de se développer jusqu’à des gammes de pH de 4,0-8,0. La densité optique a été mesurée à 560 nm et les données ont été tracées. La croissance maximale (DO) des isolats M1, M3 et S2 a été trouvée 2.201, 2.0619 et 2.237, respectivement à pH 6.0 tandis que la croissance maximale des isolats M2 était 2.259 à pH 6.5 (Fig. 5). Les isolats ont été capables de croître à un pH compris entre 4,0 et 8,0 mais la croissance optimale a été observée à un pH compris entre 5,0 et 6,5 lorsqu’ils ont été cultivés dans un bouillon MRS à 37°C. De cette étude, on peut conclure que le taux de croissance de Lactobacillus spp, diminue à un certain stade lorsque la concentration du pH augmente (Chowdhury et al…, 2012).

Quantification de l’acide organique et détermination du pH : Pour la quantification de l’acide organique, la méthode de titrage a été utilisée.

Quantification de l’acide organique = V×N×D

où, V est le volume de NaOH, N est la force de NaOH et D est le facteur de dilution. Le résultat de la production d’acide organique est présenté dans le tableau 2.

Cette étude indique que la production d’acide organique a augmenté avec le temps d’incubation mais en même temps le pH du milieu a diminué avec l’augmentation de la production d’acide. D’après le résultat (tableau 2), l’acidité la plus élevée (1,9%) et le pH le plus bas (3,64) ont été observés après 72 heures d’incubation à 37°C pour le probiotique Lactobacillus isolé du yaourt Bogra. D’autres bactéries probiotiques isolées de yaourts de différents supermarchés de Chittagong ont montré l’acidité la plus élevée 1,83, 2,11 et 2,11% et le pH le plus bas 3,9, 3,68 et 3,65, respectivement après 72 h d’incubation.

Il existe une variation mineure dans la production d’acide organique par les lactobacilles en raison de leurs différences régionales, indiquant que ces isolats sont légèrement dépendants du climat et de l’environnement (Hoque et al…, 2010).

Criblage de l’interférence avec les bactéries pathogènes : Les probiotiques, y compris Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus spp, sont connus pour être inhibiteurs de la croissance d’un large éventail de pathogènes intestinaux chez l’homme. En plus des effets favorables contre les maladies causées par un déséquilibre de la microflore intestinale, plusieurs observations expérimentales de bactéries contre le développement de tumeurs du côlon sont rapportées par Dunne et al. (2001) et Wollowski et al. (2001).

Dans cette étude, les 4 isolats sélectionnés ont été examinés selon leur activité antibactérienne contre différentes bactéries pathogènes telles que Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli et Shigella sonnei associées à des maladies d’origine alimentaire. La comparaison de leur inhibition (en mm) contre 8 pathogènes testés est présentée dans le tableau 3.

Les résultats expérimentaux ont montré que l’activité inhibitrice la plus élevée de l’isolat M1 a été démontrée contre Bacillus cereus (51,20±1,22 mm) et la plus faible zone d’inhibition était (23,46±1,00 mm) contre Shigella sonnei après 72 h d’incubation. Le plus grand diamètre de la zone d’inhibition de l’isolat M2 a été montré contre E. coli (38,43±1,00 mm) et la zone la plus faible (20,10±1,00 mm) contre Bacillus megaterium après 72 heures d’incubation. De même, le plus grand diamètre de la zone d’inhibition de l’isolat M3 a été montré contre P. aeruginosa (42,90±1,20 mm) et la zone la plus faible (17,83±1,10 mm) contre S. aureus. Et finalement, dans l’isolat S2, la zone la plus élevée a été observée contre E. coli (43,80±1,20 mm) et la zone la plus faible (21,63±1,10 mm) contre S. aureus après 72 heures d’incubation. Les résultats liés à Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae et Escherichia coli ont été jugés pertinents par rapport aux résultats de Chowdhury et al. (2012).

Dans la présente étude, les isolats M1, M2, M3 et S2 ont montré des résultats satisfaisants concernant l’activité bactériocide et bactériostatique. L’isolat M1 était bactéricide pour Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei et bactériostatique pour Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus et E. coli. L’isolat M2 était bactéricide pour Bacillus cereus, Shigella sonnei et bactériostatique pour Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli. L’isolat M3 était bactéricide pour Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium et Staphylococcus aureus et bactériostatique pour Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli et Shigella sonnei et l’isolat S2 était bactéricide pour Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae et Shigella sonnei et bactériostatique pour Bacillus megaterium et Escherichia coli.

CONCLUSION

Dans cette étude, les Lactobacillus spp, ont été isolées et identifiées à partir de yaourts régionaux sélectifs. Pour l’identification des bactéries, plusieurs tests bactériologiques et biochimiques ont été réalisés. En outre, une PCR a été réalisée à l’aide d’amorces spécifiques au genre (LbLMA-rev) et universelles (amorce R16-1) correspondant à la région de l’espaceur intergénique de l’ARNr 16-23S des Lactobacillus spp. pour confirmer l’identification bactériologique. Les Lactobacillus spp. isolés étaient capables de tolérer des substances inhibitrices comme le NaCl (1-9%) et le sel biliaire (0,05-0,3%) et également capables de survivre dans des conditions alcalines (pH 8,0). Tous ces isolats (M1, M2, M3 et S2) étaient capables d’utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le xylose, le sucrose, le fructose, le galactose, le lactose, le maltose, le ribose, le rhamnose, le mannitol et le dextrose. De plus, les Lactobacillus spp. isolés des 4 isolats (M1, M2, M3 et S2) étaient capables de produire de l’acide organique dans le lait. Cette enquête indique qu’il existe une variation mineure dans la production d’acide organique par les Lactobacillus en raison de leur variation régionale. La présence d’activités antibactériennes des 4 isolats (M1, M2, M3 et S2) contre huit bactéries pathogènes humaines communes a été jugée satisfaisante et les isolats produisent de la bactériocine de manière extracellulaire. Un probiotique doit être capable d’inhiber les organismes pathogènes et de tolérer les conditions difficiles de l’intestin humain, telles qu’une forte teneur en sel, un faible pH et une forte concentration de sels biliaires. Tous les Lactobacillus spp. isolés remplissent ces critères et peuvent donc être considérés comme des probiotiques potentiels pour la santé humaine.