Abstract

Contexte. La détection précoce des bactériémies à Gram positif et une thérapie antimicrobienne appropriée en temps opportun sont nécessaires pour diminuer la mortalité des patients. L’objectif de notre étude était d’évaluer les performances du test d’hémoculture Verigene Gram positif (BC-GP) dans deux établissements de santé spéciaux et de déterminer l’impact potentiel du test rapide d’hémoculture pour la bactériémie à Gram positif au sein du système de prestation de soins japonais. En outre, l’étude comprenait des hémocultures simulées, dont une bibliothèque d’isolats de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) et d’entérocoques résistant à la vancomycine (ERV) bien caractérisés, reflétant différentes régions géographiques du Japon. Méthodes. Au total, 347 tests BC-GP ont été réalisés sur des hémocultures cliniques et simulées. Les résultats du BC-GP ont été comparés aux résultats obtenus par des méthodes de référence pour l’identification du genre/espèce et la détection des gènes de résistance à l’aide de méthodologies moléculaires et MALDI-TOF MS. Résultats. Pour l’identification et la détection des gènes de résistance sur deux sites cliniques et des hémocultures simulées, la concordance globale du BC-GP avec les méthodes de référence était de 327/347 (94 %). Le temps d’identification et de détection de la résistance aux antimicrobiens par BC-GP était significativement plus court par rapport aux tests de routine, en particulier à l’hôpital de cardiologie, qui ne propose pas de services de microbiologie clinique les week-ends et les jours fériés. Conclusion. Le BC-GP a généré une identification et une détection précises des marqueurs de résistance par rapport aux méthodes de laboratoire de routine pour les organismes Gram-positifs dans les milieux cliniques spécialisés fournissant des résultats plus rapides que les tests de routine actuels.

1. Introduction

Les bactéries à Gram positif sont les micro-organismes les plus prédominants associés à la septicémie dans les établissements de soins de santé et la cause la plus fréquente de bactériémie chez les patients ayant subi une transplantation de cellules souches hématopoïétiques . La bactériémie à entérocoques est associée à un risque accru de mortalité chez les patients ayant subi une transplantation de cellules souches hématopoïétiques, indépendamment de leur sensibilité à la vancomycine. Dans les unités de cardiologie, l’endocardite infectieuse, l’anévrisme infectieux, les infections sanguines liées aux cathéters ou les infections du site chirurgical après des interventions cardiaques sont les principales infections pour lesquelles les micro-organismes responsables les plus courants sont les cocci à Gram positif. Dans les deux unités médicales, la détection précoce des Gram positifs et des marqueurs résistants est très critique dans la gestion des soins aux patients, l’intendance des antibiotiques et la prévention de la propagation des micro-organismes résistants.

Comme une intervention précoce avec une thérapie antimicrobienne est associée à un meilleur pronostic, chaque heure de retard étant associée à une mortalité accrue, un diagnostic rapide est essentiel . Le test Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) est un système de microréseau de l’échantillon au résultat pour l’identification des bactéries Gram-positives communes et des principaux marqueurs de résistance directement à partir d’une culture sanguine positive. Bien qu’un certain nombre d’études aient précédemment évalué les performances de rapport du BC-GP, allant de 92 à 99% de concordance avec la méthodologie conventionnelle , une limitation des rapports précédents a été que beaucoup d’études ont été menées aux États-Unis ainsi que dans des pays en dehors du Japon, avec un seul rapport publié de portée limitée au Japon .

La variation génétique entre les lignées bactériennes circulant dans différentes régions géographiques du monde peut affecter la sensibilité des tests moléculaires basés sur des sondes oligonucléotidiques pour détecter les organismes ou les marqueurs de résistance. Des études menées à Hong Kong et en Belgique ont fait état d’une performance plus faible du BC-GP.

L’objectif de cette étude était de déterminer l’impact potentiel sur la prise en charge et les résultats des patients du BC-GP dans les milieux hospitaliers spécialisés au sein de l’environnement de soins de santé japonais, qui fait face à un certain nombre de défis. Une population de plus en plus vieillissante et l’augmentation des coûts globaux des soins de santé qui l’accompagne ont mis au défi l’infrastructure des soins de santé. Bien que le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) soit responsable de plus de 90 % des infections nosocomiales causées par des bactéries résistantes au Japon, l’externalisation des tests de microbiologie clinique ou l’absence de couverture le week-end sont courantes dans de nombreux établissements de santé dans le cadre de la limitation des coûts. Cet article représente la première évaluation complète du BC-GP au Japon pour valider ses performances cliniques. L’étude d’hémoculture simulée comprend une bibliothèque de souches bien caractérisées de SARM associés aux soins de santé (HA-MRSA), de SARM acquis dans la communauté (CA-MRSA) et d’entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) circulant au Japon.

2. Méthodes

BC-GP a été évalué à l’hôpital Toranomon (TH) et à l’Institut de cardiologie Sakakibara (SHI), conformément aux protocoles d’étude approuvés par le comité d’examen institutionnel propre à chaque site, du 26 juin 2012 au 6 mars 2013. TH est un hôpital universitaire général de 1168 lits avec une unité de soins hématologiques de 123 lits pour la transplantation de cellules souches hématopoïétiques réalisant 140 à 160 transplantations de cellules souches hématopoïétiques par an. Le laboratoire de microbiologie de l’hôpital fonctionne tous les jours pendant la journée. Le SHI est un hôpital universitaire de 320 lits, spécialisé dans les maladies cardiovasculaires, qui effectue plus de 1 500 opérations à cœur ouvert par an. Le laboratoire de microbiologie de l’hôpital est exploité par un laboratoire de référence commercial extérieur. Le laboratoire de microbiologie fonctionne pendant l’équipe de jour en semaine et est fermé le week-end et les jours fériés.

Les hémocultures ont été réalisées à SHI en utilisant des flacons BacT/ALERT FA et le contrôle avec BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France). TH a utilisé des flacons BACTEC Plus et un contrôle avec BACTEC 9240 et FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, et NJ). Un seul flacon d’hémoculture positive contenant des cocci ou des bacilles à Gram positif par patient a été inclus dans l’étude. Deux ml de milieu d’hémoculture positif ont été conservés à -85C pour une nouvelle analyse.

L’identification microbiologique de routine et l’antibiogramme des isolats ont été réalisés à l’aide de tests d’identification conventionnels tels que la solubilité biliaire, la sensibilité au disque d’optochine et le système MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) chez TH et le système Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) chez SHI. Le dépistage de la résistance à la méthicilline par la céfoxitine a été effectué conformément aux directives du CLSI . Un test d’agglutination au latex pour la détection de la protéine de liaison à la pénicilline PBP2a a également été utilisé .

Le test BC-GP a été réalisé sur une hémoculture positive montrant des organismes Gram positifs selon les instructions du fabricant. En bref, un échantillon bien mélangé de 350 μl du milieu d’hémoculture a été pipeté dans le puits d’échantillon du plateau d’extraction nucléique BC-GP, placé sur le Verigene Processor SP pour le traitement et l’analyse par le Verigene Reader.

Une évaluation a été réalisée pour déterminer la différence de temps entre la déclaration des résultats utilisant le BC-GP et les résultats d’identification et de sensibilité aux antimicrobiens basés sur la culture pour 139 bouillons d’hémoculture positifs. Pour les résultats basés sur la culture, le temps nécessaire à la génération du rapport final était le temps entre la lecture de la coloration de Gram et la saisie des résultats finaux d’identification et de sensibilité dans le système d’information du laboratoire. Pour le BC-GP, le temps nécessaire pour obtenir un résultat était le temps entre la lecture de la coloration de Gram et la saisie des résultats du BC-GP dans le système d’information du laboratoire.

Un ensemble de défi de 208 hémocultures simulées a été construit en utilisant le type, les souches de référence et les souches cliniques de différentes régions géographiques du Japon pour évaluer le BC-GP. Les souches cliniques comprenaient des organismes qui ont présenté des défis pour les systèmes d’identification commerciaux dans des études cliniques précédentes à TH et SHI. En outre, une bibliothèque de souches HA-MRSA, CA-MRSA et ERV bien caractérisées provenant du Japon a également été testée. Des études d’hémoculture simulée ont été réalisées au laboratoire médical Miroku (ville de Saku, préfecture de Nagano, Japon). Deux cent huit souches ont été ajustées à une turbidité d’environ 100 UFC/ml dans une solution saline stérile. Trois cents μl ont été inoculés dans des flacons BACTEC Plus Aerobic/F contenant 8 à 10 ml de sang entier humain (groupe sanguin O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) pour un inoculum final de 30 UFC/bouteille. Une bouteille BACTEC Plus Anaerobic/F a également été inoculée pour S. pneumoniae et le groupe S. anginosus. Chaque bouteille a été incubée dans le système BACTEC jusqu’à ce qu’un signal positif soit généré. Si le système BACTEC générait des résultats négatifs, on testait à nouveau le milieu d’hémoculture dilué 11 fois avec de l’eau distillée stérile.

Chacun des isolats d’hémoculture positifs des deux sites hospitaliers a été conservé dans du lait écrémé à 10 % (Difco) à -85C. L’identification des espèces a été confirmée par spectrométrie de masse à désorption laser assistée par matrice et temps de vol (MALDI-TOF MS) (Microflex LT avec Biotyper ver. 3.0 ; Bruker Daltonik GmbH, Brême, Allemagne) pour toutes les souches. Si l’organisme n’a pas été identifié au niveau de l’espèce par MALDI-TOF MS (valeur de score < 2,0) ou identifié comme Micrococcus, Listeria, Staphylococcus autre que S. aureus, Streptococcus autre que S. pyogenes et S. agalactiae, des tests de confirmation par PCR-séquençage direct de l’ADNr 16S ou du sodA ont été effectués à l’Université Juntendo ou à l’Université médicale des femmes de Tokyo. Une PCR spécifique a été réalisée pour détecter mecA dans tous les staphylocoques et vanA, vanB dans tous les entérocoques. Les méthodes utilisées pour le typage SCCmec des SARM acquis dans la communauté ou associés aux soins de santé utilisées pour caractériser les souches ont été décrites précédemment .

La concordance a été déterminée en comparaison avec les résultats des méthodes de référence. Il y avait concordance si la détection de la cible BC-GP correspondait à la méthode de référence au niveau du genre ou de l’espèce. La concordance combinée entre la PCR et le BC-GP pour la détection du mecA était de 71/73 (97 %) pour les hémocultures prospectives et les hémocultures simulées.

La précision d’identification combinée des deux sites hospitaliers était de 129/139 (93 %). Pour les cultures monomicrobiennes, la précision d’identification était de 121/124 (98%). La concordance entre la PCR et le BC-GP pour la positivité du mecA était de 51/53 (96%). Le tableau 1 présente les résultats de la TH. Dans l’ensemble, 96/104 (92 %) organismes ont été correctement identifiés par le BC-GP au niveau de l’espèce ou du genre, y compris la détection des gènes de résistance. Comme le montre le tableau 2, la concordance totale du BC-GP avec la méthode de référence au SHI était de 33/35 (94%) organismes.

Le BC-GP signale la présence du mecA uniquement pour S. aureus et S. epidermidis. Dans cette étude, sur les 102 souches de staphylocoques, 72 étaient soit S. aureus soit S. epidermidis. Les résultats discordants étaient dus à des organismes mecA S. epidermidis indétectables dans des cultures polymicrobiennes contenant à la fois des S. epidermidis mecA positifs et des S. epidermidis mecA négatifs. Sur les 30 Staphylococcus spp. autres que S. epidermidis et S. aureus, 21 (70 %) étaient positifs pour le mecA, dont 2 S. lugdunensis, qui ne pouvaient pas être signalés comme positifs pour le mecA par le BC-GP.

Le tableau 3 montre la différence de temps entre la génération des résultats du BC-GP et les résultats d’identification finale et de sensibilité aux antimicrobiens basés sur la culture dans les deux hôpitaux. Les résultats du BC-GP étaient disponibles en moyenne de 28,2 à 51,0 heures avant l’identification finale basée sur la culture et les résultats de sensibilité à TH. Au SHI, le BC-GP a généré des résultats en moyenne de 34,5 à 196,6 heures plus tôt. En comparant le temps nécessaire pour obtenir les résultats finaux d’identification et de sensibilité basés sur la culture chez TH et SHI, à l’exception de S. aureus, les résultats pour S. epidermidis et les staphylocoques à coagulase négative autres que S. epidermidis, les entérocoques et les streptocoques ont nécessité un temps significativement () plus long chez SHI (83,3, 123,6, 159,1 et 199,1 heures, respectivement) par rapport à TH (40,8, 53,9, 36,1 et 53,5 heures, respectivement).

En utilisant des hémocultures à Gram positif simulées, le BC-GP a correctement identifié 198/208 (95%) des organismes (tableau 4). Six streptocoques (3 %) ont été soit incorrectement identifiés, soit identifiés au niveau du genre uniquement par le BC-GP. En ce qui concerne les 4 flacons d’hémoculture BC-GP faussement négatifs, 1 S. pyogenes a été correctement identifié et 1 S. mitis a généré un signal positif de Streptococcus genus/S. pneumoniae après dilution au facteur 11 du milieu d’hémoculture. Le gène mecA a été détecté dans 20/20 (100 %) organismes MRSA représentant des souches communautaires (SCCmec type IIa, IV et V) et des souches associées aux soins (SCCmec type I, IIb, III et non typables) par BC-GP. Le BC-GP a détecté 14/14 (100%) gènes vanA et 20/20 (100%) gènes vanB dans des souches d’ERV bien caractérisées provenant d’études antérieures au Japon.

4. Discussion

La performance de BC-GP observée dans notre étude était similaire aux rapports précédents . Comme les services de microbiologie clinique sont externalisés ou ne fonctionnent pas pendant les heures creuses en semaine et sont fermés les week-ends et les jours fériés dans de nombreux hôpitaux au Japon, les tests de diagnostic rapide ont un potentiel important pour avoir un impact sur les soins aux patients en réduisant considérablement le temps d’identification des organismes et les résultats de la sensibilité aux antimicrobiens.

Le BC-GP détecte le mecA dans tous les staphylocoques en se basant sur la mesure de l’intensité du signal ; cependant, la déclaration est limitée à S. aureus et S. epidermidis sur la base d’un algorithme dans lequel le mecA n’est déclaré que lorsque S. aureus ou S. epidermidis est détecté par le BC-GP. Les futures versions du BC-GP devraient envisager la modification de l’algorithme pour permettre la déclaration de la détection du mecA pour les staphylocoques autres que S. aureus ou S. epidermidis, car 70 % des 30 souches autres que S. aureus et S. epidermidis dans notre étude étaient résistantes à la méthicilline. Bien que S. epidermidis soit le principal agent pathogène staphylococcique à coagulase négative, d’autres staphylocoques tels que S. lugdunensis et S. haemolyticus sont des agents pathogènes importants dans l’environnement des soins de santé.

Les hémocultures positives poly-microbiennes ont généré la majorité des discordances. En revanche, la performance du BC-GP était de 121/124 (98%) dans les hémocultures cliniques monomicrobiennes et de 198/208 (95%) dans les hémocultures simulées. Dans cette étude, les hémocultures polymicrobiennes représentaient respectivement 14/106 (13%) et 3/33 (9%) des hémocultures positives chez TH et SH. Au total, les hémocultures polymicrobiennes représentaient 17/139 (12 %) des hémocultures cliniques prospectives, ce qui est cohérent avec les études précédentes rapportant que 6 à 20 % de toutes les infections sanguines sont polymicrobiennes. Le BC-GP a correctement identifié tous les organismes dans 12/17 (70%) des cultures polymicrobiennes. Dans les études précédentes sur le BC-GP, les taux d’identification correcte des cultures polymicrobiennes étaient compris entre 57 et 86 %. Comme des informations trompeuses peuvent affecter le diagnostic clinique, entraînant une sélection inappropriée d’agents antimicrobiens, il est nécessaire de comprendre les limites du BC-GP.

Une préoccupation supplémentaire avec les cultures polymicrobiennes est l’interprétation clinique de la détection du mecA et de la détection du staphylocoque. Dans nos 17 cultures polymicrobiennes, 5 échantillons ont donné 2 ou 3 souches staphylococciques avec ou sans mecA. Cela peut conduire à une utilisation inutile de vancomycine ou à une sous-estimation de l’infection causée par des staphylocoques résistants à la méthicilline. La répétition du BC-GP sur une autre série d’hémocultures peut réduire le risque de ce problème. Pour les cultures monomicrobiennes ou les cultures simulées, toutes les divergences ont été observées avec les streptocoques, à l’exception d’une souche de S. caprae. Les erreurs d’identification du BC-GP pour les streptocoques comprenaient 2 S. mitis identifiés comme S. pneumoniae, la non-détection de 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group et 2 S. pyogenes. Des rapports antérieurs ont également fait état de résultats similaires pour S. mitis, S. oralis et S. pneumoniae . Comme la parenté génétique entre S. mitis, S. oralis et S. pneumoniae est bien connue sur la base d’une homologie de >99% des séquences du gène de l’ARNr 16S, les résultats du BC-GP pour S. pneumoniae ou Streptococcus avec alpha-hémolyse sans aucun signal positif spécifique à l’espèce doivent être soigneusement interprétés et confirmés par des méthodes conventionnelles telles que la sensibilité à l’optochine ou le test de solubilité biliaire. Il est intéressant de noter qu’une dilution de 11 fois du milieu d’hémoculture d’origine peut conduire à la détection du signal Streptococcus et du signal d’espèce (tableau 4). Une gamme de détection en fonction de l’organisme par le BC-GP a été rapportée.

Le principal avantage de l’utilisation du BC-GP est le temps plus rapide pour rapporter l’identification et les déterminants de la résistance à partir d’hémocultures positives, ce qui permet de sélectionner plus tôt la thérapie antimicrobienne appropriée et de mettre en œuvre des mesures de contrôle de l’infection telles que l’isolement et la précaution de contact. Cela pourrait avoir un impact significatif sur le système de soins de santé japonais. La différence de temps entre les résultats du BC-GP et les résultats finaux de l’identification et de la sensibilité basés sur la culture présentés dans le tableau 3 à TH est conforme aux rapports précédents . En revanche, les résultats antérieurs de 80,7 à 196,6 heures pour les organismes autres que S. aureus en utilisant le BC-GP au SHI reflètent l’indisponibilité des services de microbiologie clinique pendant les week-ends et les jours fériés. Étant donné que les services de microbiologie clinique sont externalisés dans de nombreux hôpitaux japonais, qu’ils sont limités à une seule équipe pendant la semaine ou qu’ils ne sont pas proposés le week-end, les coûts-avantages potentiels du maintien des services d’hémoculture dans les hôpitaux sont importants. En outre, la formation du personnel du laboratoire général à la reconnaissance des cocci et des bacilles à Gram positif permettra d’effectuer des tests BC-GP le week-end ainsi que le soir et la nuit. Le BC-GP offre la possibilité aux hôpitaux de conserver en interne un service de laboratoire très critique.

En conclusion, le BC-GP a permis une identification et une détection précises des marqueurs de résistance par rapport aux méthodes de laboratoire de routine basées sur la culture pour les organismes à Gram positif, y compris les souches CA-MRSA, HA-MRSA et ERV circulant au Japon. La réduction du délai d’optimisation de la thérapie antimicrobienne à l’aide de BC-GP peut contribuer à la réduction des coûts et à l’amélioration des soins aux patients. En 2016, BC-GP a reçu une autorisation réglementaire au Japon, devenant ainsi le premier test moléculaire multicible pour les hémocultures positives approuvé en tant que dispositif de diagnostic in vitro pour aider au diagnostic des infections bactériennes sanguines. Des études supplémentaires seront nécessaires pour valider le rapport coût-efficacité du BC-GP dans le contexte du système de prestation de soins de santé japonais.

Approbation éthique

Cette étude a été approuvée par les comités de révision internes de TH et SHI.

Intérêts concurrents

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Contributions des auteurs

Ken Kikuchi a conçu et réalisé l’étude et a rédigé le manuscrit. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa et Reiko Yabusaki ont réalisé les travaux de laboratoire. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka, et Akiko Yoneyama ont supervisé la collecte des données et coordonné et participé à la conception de l’étude.

Remerciements

Cette étude a été soutenue, en partie, par une subvention (S0991013) du ministère de l’Éducation, de la Culture, du Sport, de la Science et de la Technologie, Japon (MEXT), pour la Fondation des projets de recherche stratégique dans les universités privées.