La mise en place de systèmes de transformation génétique a permis aux scientifiques de transformer de l’ADN étranger en champignons filamenteux et d’obtenir ainsi les souches souhaitées à des fins industrielles. Nous pouvons maintenant profiter pleinement du pouvoir sécrétoire supérieur des champignons et de leur excellente efficacité dans la fabrication de métabolites précieux.

Transformation à médiation par protoplastes (PMT)

La PMT est la méthode de transformation fongique la plus utilisée, qui repose sur un grand nombre de protoplastes fongiques compétents. Le principe consiste à utiliser certaines enzymes disponibles dans le commerce pour éliminer les composants complexes de la paroi cellulaire fongique afin de générer des protoplastes. Ensuite, certains réactifs chimiques (comme le PEG) sont utilisés pour favoriser la fusion des acides nucléiques exogènes et des protoplastes, comme décrit plus en détail ci-dessous. Les composants de la paroi cellulaire fongique sont très variables entre les différentes souches. Même les composants de l’enveloppe de la spore sont significativement différents de ceux des hyphes de la même souche. Il n’existe donc pas de méthode de transformation universelle qui puisse être appliquée à différentes souches fongiques. La préparation du protoplaste peut difficilement être standardisée. Une partie des difficultés vient de notre connaissance limitée des hydrolases de la paroi cellulaire. Le développement d’une méthode PMT optimisée pour les champignons nécessite encore des efforts importants.

La PMT est une méthode de transformation couramment utilisée. La méthode a été constamment améliorée pour atteindre une plus grande efficacité pour la transformation génétique et pour cibler des loci génétiques appropriés par l’édition de gènes. La préparation des protoplastes nécessite l’élimination de la paroi cellulaire, ce qui est principalement réalisé par un traitement enzymatique. Des méthodes non enzymatiques de préparation des protoplastes ont également été signalées, telles que des méthodes physiques, notamment le broyage et le choc d’ondes supersoniques. Cependant, elles ne sont pas largement utilisées en raison de leurs inconvénients pratiques et du faible rendement des protoplastes. Un résumé des protocoles de transformation médiée par protoplaste pour différentes espèces fongiques est fourni dans le tableau 1.

Étapes de base de la méthode PMT

La PMT a été appliquée pour la première fois à Saccharomyces cerevisiae. Les chercheurs ont préparé des protoplastes avec la snailase commerciale, et ont utilisé du sorbitol pour conserver les protoplastes. Plus tard, cette méthode a été appliquée aux champignons filamenteux, tels que Neurospora crassa et A. nidulans. Bien que les méthodes de transformation aient été améliorées, les étapes de base restent essentiellement les mêmes. Les étapes de base de la méthode PMT sont fournies dans la figure 1.

Étapes fondamentales de la transformation médiée par les protoplastes

Préparation des protoplastes

La première étape de la préparation des protoplastes consiste à éliminer la paroi cellulaire par digestion enzymatique. La paroi cellulaire fongique est composée de glucane, de mannane et de chitine. La structure de la paroi cellulaire fongique est très dynamique, et la paroi cellulaire varie au cours de la division cellulaire et de la croissance des champignons, ainsi que lors de la germination des spores, de la ramification hyphale et de la formation du diaphragme. Les composants de la paroi cellulaire sont également différents selon les espèces fongiques, c’est pourquoi il faut utiliser plusieurs enzymes en combinaison. Il a été signalé que la sélection d’un mélange d’enzymes approprié est un facteur clé dans la préparation des protoplastes .

En général, les hyphes sont sensibles à une enzyme appropriée qui hydrolyse sa paroi cellulaire pendant la phase logarithmique. Dans la procédure PMT de Neurospora, les protoplastes sont préparés en hydrolysant les hyphes nouvellement nés (culture pendant 4-6 h sous 25-30 °C) . De même, les protoplastes peuvent également être préparés avec des conidiospores. Par exemple, pour Aspergillus et Penicillium, on peut choisir des spores germinales ou des thalles .

Les protoplastes sont sensibles à la pression osmotique, il faut veiller à maintenir une pression osmotique stable pour garder les protoplastes intacts pendant l’enzymolyse des parois cellulaires. Ainsi, des stabilisateurs osmotiques (tels que le sorbitol, le chlorure de sodium et le chlorure de potassium) doivent être inclus dans tous les tampons pour la préparation des protoplastes afin d’éviter la rupture des cellules. Par exemple, une solution de sorbitol d’une concentration de 0,8 à 1,2 M est utilisée dans la préparation des protoplastes de N. crassa, Aspergillus sp. et Trichoderma sp. pour maintenir la stabilité osmotique des protoplastes. Un résumé des paramètres de préparation des protoplastes pour certaines espèces fongiques communes est fourni dans le tableau 2.

Acquisition d’ADN exogène

La solution utilisée pour suspendre les protoplastes contient généralement des ions calcium et des stabilisateurs osmotiques. On pense que le calcium ouvre des canaux dans la cytomembrane, ce qui facilite l’entrée de l’ADN exogène dans la cellule, tandis que les stabilisateurs osmotiques sont nécessaires pour maintenir la morphologie des protoplastes. Habituellement, une certaine quantité de polyéthylène glycol (PEG) est ajoutée à l’ADN purifié (qui peut être de l’ADN circulaire double brin ou de l’ADN linéarisé). Le PEG est un promoteur de fusion cellulaire couramment utilisé. Il peut former le pont moléculaire entre les cellules ou entre la cytomembrane et l’ADN, et favorise ainsi l’adhésion. En outre, il peut également induire des charges désordonnées sur la surface de la cytomembrane, modifier la perméabilité de la membrane et faciliter l’entrée d’acides nucléiques exogènes dans les cellules .

Le PEG est un agent crucial améliorant l’efficacité de la transformation. Une faible efficacité de transformation dans la plupart des cas peut être améliorée en ajoutant plus de PEG. Dans des conditions normales, la performance du PEG à faible poids moléculaire (comme le PEG3000) est supérieure à celle du PEG à haut poids moléculaire (comme le PEG8000). Cependant, cela doit être optimisé pour diverses espèces .

L’efficacité de la transformation est également influencée par la température. En général, le mélange d’ADN et de protoplastes doit être placé sur la glace pendant 15 à 30 min, afin que l’ADN puisse adhérer à la surface des protoplastes .

Régénération des protoplastes

Afin de garantir une bonne récupération des protoplastes viables, on laisse les protoplastes récupérer sur la plaque sans pression de sélection pendant une certaine quantité avant de les transférer sur une plaque sélective. Un stabilisateur osmotique doit être inclus dans la culture de régénération. Une pression osmotique stable est le facteur clé pour que le protoplaste régénère la paroi cellulaire. Seuls les protoplastes qui portent des acides nucléiques exogènes peuvent croître sur le milieu sélectif.

Commentaires sur la méthode PMT

La méthode de transformation des protoplastes est simple et efficace, sans besoin d’équipement coûteux. Mais le protocole implique de nombreuses étapes et des réactifs critiques. Chaque étape doit être optimisée et la qualité des réactifs doit être testée de manière critique. L’état de croissance des champignons transformés doit être soigneusement surveillé. L’expérience est essentielle pour la mise en œuvre réussie de cette méthode.

Transformation médiée par Agrobacterium (AMT)

Agrobacterium est une bactérie Gram-négative que l’on trouve couramment dans le sol. Agrobacterium tumefaciens peut infecter les plantes blessées. Le plasmide inducteur de tumeur de > 200 kb, qui est également appelé plasmide Ti, a pu être isolé au stade précoce de l’infection. Lorsque A. tumefaciens infecte une plante, il pénètre dans la plante par la blessure, et intègre une partie du plasmide Ti dans le génome des cellules végétales infectées. Le fragment d’ADN intégré du plasmide Ti est communément appelé ADN de transfert ou ADN-T. L’ADN-T s’insère dans le génome des cellules de la plante infectée. L’ADN-T s’insère dans le génome de la plante de manière aléatoire sous forme de monoclone. L’ADN-T est flanqué de deux répétitions imparfaites directionnelles (appelées bordure gauche et bordure droite) et contient des gènes qui codent pour des enzymes responsables de la formation d’hormones végétales, qui provoquent la croissance des tumeurs . Un vecteur binaire a été conçu pour que le gène cible soit inséré entre les frontières gauche et droite de l’ADN-T, et le plasmide recombinant a été transformé dans l’Agrobacterium tumefaciens. Le clone positif d’Agrobacterium a été utilisé comme véhicule pour intégrer le gène cible dans le génome du champignon. Les étapes spécifiques seront discutées en détail ci-dessous.

La méthode AMT s’est avérée plus stable et plus efficace que les méthodes de transformation conventionnelles depuis le premier article rapportant que cette méthode pouvait être appliquée à la transformation fongique. La méthode AMT a d’abord été appliquée pour transformer S. cerevisiae . Un plasmide portant un gène de résistance à l’hygromycine est généralement utilisé pour transformer Aspergillus awamori . La méthode AMT a été appliquée à de nombreux Ascomycètes, dont Aspergillus et Monascus purpureus. Les étapes de base de la méthode AMT sont présentées à la figure 2. Un résumé du protocole de transformation médiée par Agrobacterium pour différentes espèces fongiques est fourni dans le tableau 3.

Les étapes de base de la transformation médiée par Agrobacterium

Facteurs qui influencent l’efficacité de l’AMT

De nombreux facteurs influencent l’efficacité de l’AMT, notamment le type de matériel fongique de départ (protoplaste, spore, hyphe et tissu du corps du fruit), la concentration de l’acétosyringone, le rapport entre le champignon et Agrobacterium, et la condition de coculture.

1. Le type de matériel fongique de départ La méthode AMT peut utiliser les protoplastes, les spores, les hyphes et le tissu du corps fruitier des champignons comme récepteur. Des matériaux de départ appropriés doivent être sélectionnés pour les différentes souches. Par exemple, la méthode AMT ne fonctionne que pour les protoplastes de Rhizopus. oryzae et Mucor circinelloides, tandis que les spores ou les spores germinales ne produiraient pas de transformants .

2. La concentration d’acétosyringone (AS) AS agit sur deux étapes au cours du processus AMT. L’une est le processus d’induction, et l’autre est le processus de transformation. L’AS est généralement utilisé pour induire l’expression du domaine Vir de l’ADN-T, et le gène du domaine Vir active le transfert de l’ADN-T. De nombreuses études ont démontré qu’une quantité appropriée de SA était nécessaire pendant le processus de transformation. Cependant, l’ajout d’AS n’est pas absolument nécessaire pendant la phase de préculture de l’Agrobacterium, ce qui pourrait réduire l’efficacité de la transformation pour certaines souches. La concentration de l’AS est un facteur important qui affecte l’efficacité de la transformation pendant le processus de co-culture champignon-Agrobacterium dans l’AMT d’Aspergillus awamori .

3. Le ratio de champignons par rapport à l’Agrobacterium Dans certaines limites, l’efficacité de la transformation atteindra le niveau maximum avec l’augmentation de la quantité de champignon ou d’Agrobacterium. Un ratio optimal pour l’AMT pour différents champignons doit être déterminé empiriquement. Le ratio des cellules fongiques par rapport à celui des cellules bactériennes doit être optimisé pour différents systèmes de transformation champignon-Agrobacterium.

4. La condition de coculture Les conditions de coculture sont un facteur important dans la méthode AMT. Cela comprend le temps de culture, la température, le pH et le choix du filtre. La température et le temps de co-culture sont les facteurs clés parmi les étapes de l’AMT. Pour la transformation champignon-Agrobacterium, une température de 20-28 °C et une durée de co-culture de 16-96 h constituent des conditions de départ appropriées. Une température plus basse (20-25 °C) est généralement bénéfique pour la méthode AMT. Le filtre, qui est hydrophile et sert de support à la co-culture champignon-Agrobacterium, facilite le transfert des colonies individuelles sur la plaque de criblage. Une membrane de nitrocellulose, une membrane de nylon, un papier filtre, de la cellophane et une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) peuvent être utilisés comme filtre .

Commentaires sur la transformation médiée par Agrobacterium

La méthode AMT ouvre une nouvelle voie pour les champignons récalcitrants à la transformation par les méthodes conventionnelles. La méthode AMT est particulièrement adaptée pour générer des mutations knock-in chez les champignons car l’ADN-T s’insère de manière aléatoire dans le génome en une seule copie. En outre, l’AMT peut atteindre une efficacité de recombinaison homologue élevée dans diverses expériences de ciblage de gènes .

Les principaux avantages de la méthode AMT comprennent : premièrement, des récipients de transformation diversifiés, y compris les protoplastes, les hyphes et les spores ; deuxièmement, la capacité d’intégrer des gènes exogènes dans le génome pour former des transformants stables ; et troisièmement, une efficacité de transformation élevée résultant en un grand nombre de transformants .

La méthode AMT nécessite des vecteurs binaires, qui sont fastidieux à préparer. De multiples facteurs doivent être pris en considération dans l’optimisation du processus de transformation. C’est une limitation majeure de la méthode AMT .

Transformation par électroporation

L’électroporation est une méthode de transformation simple, rapide et efficace pour les champignons filamenteux. Dans l’électroporation, les charges électriques sont stockées dans un condensateur pour construire une haute tension, l’échantillon est frappé par la tension d’impulsion, et l’acide nucléique exogène peut être transféré instantanément dans les cellules. Habituellement, les ondes carrées ou les ondes à décroissance exponentielle sont utilisées dans la transformation des champignons . Les impulsions à décroissance exponentielle sont générées simplement en chargeant et déchargeant un condensateur. Le champ électrique décroît exponentiellement à partir de la valeur de crête. Une onde carrée est une forme d’onde périodique non sinusoïdale (qui peut être représentée comme une somme infinie d’ondes sinusoïdales), dans laquelle l’amplitude alterne à une fréquence régulière entre des valeurs minimales et maximales fixes. Différentes formes d’onde d’électroporation sont utilisées pour différentes espèces. Un résumé des formes d’onde utilisées dans l’électroporation pour différentes espèces est fourni dans le tableau 4.

Lorsqu’une cellule est exposée au champ électrique, la structure de la cytomembrane sera modifiée avec une tension induite entre la cytomembrane. Des micropores peuvent être formés dans la cytomembrane après un choc électrique. La perméabilité de la paroi cellulaire induite est réversible dans les limites du voltage et de la durée, sinon, elle causera des dommages irréversibles aux cellules. Par conséquent, les micropores de la cytomembrane semblent présenter deux profils après un choc électrique, le profil réversible et le profil irréversible. Les molécules de lipides et de protéines dans la cytomembrane peuvent restaurer la structure originale lorsqu’une intensité de champ appropriée est appliquée, tandis que le choc électrique irréversible donnera lieu à une irréparabilité ou à une récupération extrêmement lente, ce qui conduira finalement à la mort cellulaire . L’ADN exogène peut être transféré dans la bactérie, le protoplaste végétal, la cellule animale et les champignons filamenteux par électroporation. Cette méthode a été appliquée avec succès à de nombreux champignons. Ozeki et al. ont découvert que les spores germinales se prêtent mieux à la transformation par électroporation. Ces dernières années, l’électroporation est devenue une méthode fiable pour la transformation génétique de certaines souches communes. Un résumé des protocoles de transformation médiée par électroporation pour différentes espèces fongiques est fourni dans le tableau 5.

Facteurs qui influencent la transformation par électroporation

Paramètres d’électroporation

1. Intensité du champ électrique L’intensité du champ électrique est le facteur le plus important qui influence l’efficacité de l’électroporation. Lorsque l’intensité du champ électrique appliqué atteint la magnitude de kV/cm et la largeur d’impulsion de l’échelle μs-ms, la cytomembrane sera modifiée et de nombreux micropores seront générés sur les parois cellulaires . Une intensité de champ électrique élevée est associée à un taux d’absorption élevé d’acides nucléiques exogènes et à un taux de survie cellulaire plus faible. Cependant, divers types de cellules nécessitent des intensités de champ électrique différentes en raison de différences dans les composants de la cytomembrane. Peu de micropores sont formés lorsque l’intensité du champ électrique ne dépasse pas le seuil requis. Au contraire, une intensité de champ électrique excessive entraînera des dommages irréversibles à la cytomembrane, conduisant à la mort cellulaire .

2. Capacité Pendant le processus d’électroporation, la variation des charges électriques et l’intensité du champ électrique appliqué à la suspension cellulaire dépendent de la capacité et de la durée de l’impulsion. L’intensité et la durée de l’impulsion sont également influencées par la capacité, par conséquent, une plus grande capacité a de meilleurs effets de transformation .

3. Durée et fréquence de l’impulsion La durée de la perforation sur la cytomembrane, qui est directement liée à l’efficacité de la transformation par électroporation, est influencée par la durée et la fréquence de l’impulsion .

Environnement d’électroporation et facteurs externes

1. Solution tampon La solution tampon fournit un environnement important pour l’électroporation des cellules, et la valeur pH de la solution tampon de choc électrique est d’une grande importance. Normalement, on utilise une solution tampon de pH 7,0. Les cellules sont facilement perforées et tuées à un pH supérieur à 7,0 .

2. Température Une grande quantité de chaleur est produite pendant le processus d’électroporation, qui sera libérée dans la solution tampon. Par conséquent, une température réduite (0-4 °C) est recommandée pour un meilleur effet . En outre, le bain de glace du mélange pré-choc électrique peut également améliorer l’efficacité du choc électrique.

3. Concentration de l’acide nucléique exogène Globalement, l’efficacité de l’électroporation augmente avec la concentration de l’acide nucléique exogène. L’ADN superhélice compact pénètre plus facilement dans les cellules à travers la cytomembrane. En 1995, une étude a rapporté que chaque 1 μg d’ADN plasmidique pouvait générer 100 transformants pour A. niger .

Commentaires sur la méthode d’électroporation

La méthode d’électroporation a été largement appliquée à de nombreux types de cellules, y compris les procaryotes et les eucaryotes. Cette technologie a le potentiel d’être la méthode de choix pour la transformation d’espèces fongiques inexplorées. Comparée à la méthode PMT, qui implique des étapes compliquées, l’électroporation est simple et plus pratique. Cependant, le mécanisme de l’électroporation n’est toujours pas clair. Le taux de perforation de la cytomembrane dépend de nombreux paramètres du champ électrique. Et aussi, elle nécessite des conditions tampons adaptées pour être efficace de manière optimale.

Transformation biolistique

La transformation biolistique est également connue sous le nom de bombardement de particules. Son principe est que l’ADN étranger est adsorbé à la surface de particules de tungstène ou d’or. Sous la poussée d’une haute pression, les particules sont injectées dans les cellules hôtes. Le bombardement de particules peut réaliser une transformation à la fois stable et transitoire.

Divers facteurs affectent l’efficacité du bombardement dans les modèles d’interactions complexes . Les paramètres biologiques (type de cellule, condition de croissance et densité cellulaire) et les réglages instrumentaux (type et taille des particules, niveau de vide et de pression, distance de la cible) sont des variables importantes .

Le bombardement de particules est le plus puissant parmi toutes les méthodes de transformation génétique. Il n’est pas soumis aux limitations des types de cellules de l’hôte ou de l’espèce. Pour les champignons, le bombardement de particules est suffisamment efficace pour les organismes qui sont difficiles à cultiver ou à partir desquels les protoplastes sont difficiles à préparer. Le bombardement de particules est facile et pratique à utiliser. Cependant, les instruments et les consommables pour le bombardement de particules sont coûteux. Il ne sera envisagé que dans le cas où les autres méthodes ne fonctionnent pas. Actuellement, le bombardement de particules a été utilisé pour transformer avec succès A. nidulans et T. reesei , etc.

Transformation médiée par les ondes de choc (SWMT)

La SWMT utilise le principe de transformation et de transmission de l’énergie pour générer une perturbation transitoire de la pression et une force de torsion à travers les cellules pour former un effet de cavitation transitoire . Cette méthode a été appliquée dans les traitements médicaux tels que l’orthopédie et le broyage des calculs rénaux . La méthode SWMT modifie la perméabilité des membranes cellulaires par cavitation acoustique, ce qui entraîne l’absorption d’acides nucléiques exogènes dans les cellules. La méthode a été utilisée avec succès pour introduire un acide nucléique exogène dans Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella typhimurium . En 2013, Denis Magaña-Ortíz et al. ont signalé pour la première fois l’application de la SWMT pour les champignons, notamment A. niger, Fusarium oxysporum et Phanerochaete chrysosporium . Dans cet article, trois avantages de la méthode SWMT ont été notés. Premièrement, par rapport aux méthodes de transformation conventionnelles, cette méthode est capable d’agir directement sur les spores mais pas sur les protoplastes. Deuxièmement, les paramètres physiques étaient facilement contrôlables, seuls le nombre de spores, l’énergie et la vitesse de l’onde de choc devaient être contrôlés avec précision. Troisièmement, l’efficacité de la transformation était excellente. Les résultats de Denis Magaña-Ortíz et al. ont indiqué que, par rapport à la méthode de transformation Agrobacterium, la méthode SWMT pouvait améliorer l’efficacité de la transformation de 5400 fois pour A. niger .

Mais certaines limitations de cette méthode de transformation étaient également notables. Comme une grande partie de l’ADN est endommagée lors du traitement par ondes de choc, l’efficacité de la transformation, déterminée par le rapport entre l’ADN et les cellules, était assez faible. Cependant, pour le nombre de cellules concernées, l’efficacité de la transformation était nettement plus élevée. Pour évaluer l’efficacité, il faut tenir compte de deux aspects : la quantité d’ADN et le nombre de cellules. Par exemple, dans l’expérience réalisée par Magana-Ortiz et al , en général, l’ADN plasmidique utilisé dans la transformation des protoplastes et l’électroporation est d’environ 1-10 μg . Il est coûteux et peu pratique de produire une telle quantité de plasmide en laboratoire pour la méthode SWMT. De plus, les sources et les instruments d’ondes de choc sont chers car ils sont principalement conçus à des fins médicales. Cela s’avère être un obstacle majeur à l’adoption de cette méthode dans un laboratoire de microbiologie aux ressources limitées.