Résultats et discussion

Notre nouvelle méthode AMHS est facilitée par la structure anatomique/fonctionnelle du système circulatoire des abeilles. La circulation est forcée par la contraction pulsatoire des diaphragmes dorsal et ventral, qui pompent l’hémolymphe dans le cœur. Ensuite, l’aorte transporte l’hémolymphe dans la tête (Fig 1F) , fournissant l’hémolymphe au cerveau et aux antennes de l’abeille.

Par rapport au TCHS, l’AMHS a permis la collecte de 80-100 μL d’hémolymphe stérile dans un temps plus court et sur un plus petit nombre d’individus, ce qui minimise le risque de mélanisation. Nous pensons que lors de la collecte de l’hémolymphe, il est important de minimiser le temps de son contact avec l’air. Le risque de mélanisation est réduit avec un temps de collecte plus court et une progression plus rapide vers l’étape de refroidissement. En plus de la réduction du temps de collecte, l’utilisation réduite d’insectes est un autre avantage substantiel de l’AMHS par rapport au TCHS. La recherche sur les apidés doit toujours être conçue de manière à minimiser le nombre d’abeilles qui doivent être blessées. L’utilisation de l’AMHS pour réduire le nombre d’abeilles nécessaires pour collecter un volume d’hémolymphe requis est conforme aux principes directeurs pour une utilisation plus éthique des animaux dans la recherche .

Nos résultats actuels ont également montré que la plus grande taille de l’insecte était associée à un échantillonnage d’hémolymphe plus facile et plus rapide, et à de plus grands volumes d’hémolymphe collectés (tableau 1). L’échantillonnage de l’hémolymphe d’Apis mellifera carnica et d’Apis cerana workers a pris plus de temps et a nécessité plus d’insectes que l’échantillonnage de l’hémolymphe des bourdons, car les premières espèces sont considérablement plus petites et ont moins d’hémolymphe.

L’hémolymphe est le plus souvent acquise avec des capillaires en utilisant des méthodes variables, par exemple, en ponctionnant le cœur, le sinus thoracique dorsal ou ventral, ou l’aorte dorsale . Chacune de ces procédures comporte le risque de ponctionner le ventricule, ce qui entraîne une contamination de l’échantillon par le contenu de l’intestin. Une telle contamination rend non seulement l’échantillon inutilisable, mais exige également que le capillaire soit remplacé par un nouveau ou nettoyé et désinfecté avant la prochaine utilisation – ce qui augmente le temps total de collecte de l’hémolymphe. La stérilité de l’hémolymphe peut également être compromise par la perforation de la membrane reliant les segments de l’abdomen. L’utilisation de l’AMHS élimine ces problèmes liés aux capillaires. De plus, la collecte d’hémolymphe par décapitation peut contaminer l’hémolymphe avec le nectar s’écoulant de l’estomac de l’abeille. Notre nouvelle SHAM a permis d’obtenir des échantillons d’hémolymphe de haute qualité biologique. Les hémocytes étaient clairement visibles dans chaque échantillon d’hémolymphe acquis par AMHS (Fig 1C). L’analyse de chaque lame de microscope a révélé que les échantillons d’hémolymphe obtenus par AMHS étaient purs et transparents, sans aucune contamination (par exemple, des grains de pollen).

Nous nous attendions à ce que dans la performance de l’AMHS, la désinfection à l’éthanol et le contact limité entre la goutte d’hémolymphe et le corps de l’abeille assurent la stérilité de l’échantillon. Cette attente a été confirmée par des tests microbiologiques. L’incubation de l’hémolymphe acquise par l’AMHS sur les milieux MRS et Sabouraud agar a confirmé la stérilité de l’hémolymphe. Aucune croissance de microorganisme n’a été observée sur aucune des 100 gouttes d’hémolymphe ensemencées. Par conséquent, aucun résultat quantitatif n’est présenté ici. Après la fin de la période d’incubation, nous avons seulement observé des cercles brun foncé d’hémolymphe mélanisée autour de chaque goutte. Cette mélanisation s’est produite pendant la période d’incubation, et non pendant l’échantillonnage (Fig 1D et 1E). Notamment, lorsque l’hémolymphe prélevée ne doit pas être utilisée pour des tests microbiologiques, l’étape de désinfection peut être omise. Il est possible que l’éthanol appliqué au niveau de la zone antennaire puisse affecter les activités enzymatiques ou hormonales.

Des facteurs autres que la méthodologie peuvent influencer l’efficacité de la collecte de l’hémolymphe. Dans nos études précédentes , nous avons observé que la quantité d’hémolymphe collectée d’une abeille dépend non seulement de la caste et de l’âge de l’abeille mais aussi de son degré d’hydratation mesuré sur la base du volume de nectar ou de sirop de sucre consommé avant le prélèvement de l’hémolymphe. Ptaszyńska et al. rapportent que l’échantillonnage des volumes d’hémolymphe appropriés est moins efficace chez les abeilles plus âgées. De plus, l’efficacité de l’échantillonnage peut dépendre des compétences du chercheur en matière de laboratoire. Ces facteurs rendent difficile la comparaison des caractéristiques quantitatives des différents protocoles d’échantillonnage de l’hémolymphe entre les études réalisées dans différents laboratoires et utilisant différents organismes. Notamment, dans nos enquêtes précédentes, nous avons échantillonné l’hémolymphe de milliers d’abeilles en utilisant l’AMHS, ainsi que d’autres méthodes, y compris le TCHS . Le personnel de notre laboratoire a une grande expérience de la collecte d’hémolymphe d’abeilles d’âges et de castes différents. Cette expérience nous a permis de comparer les différentes méthodes d’échantillonnage, puisque nos résultats n’ont pas été affectés par les erreurs dues aux compétences variables du personnel de laboratoire. Nos résultats actuels ont indiqué que l’AMHS était une méthode efficace, propre et très précise (tableau 1) qui prenait moins de temps que le TCHS.

L’échantillonnage de l’hémolymphe à l’aide de méthodes autres que l’AMHS nécessite généralement un équipement supplémentaire, comme des tubes microcapillaires. De plus, l’extraction de l’hémolymphe des tubes microcapillaires nécessite soit l’utilisation d’une pompe spéciale, soit l’écrasement des tubes et leur centrifugation avec des billes. Un autre avantage de l’AMHS est la possibilité d’utiliser une échelle de pipette pour mesurer le volume d’hémolymphe recueilli sur une seule abeille. Ceci est particulièrement utile pour effectuer des analyses biochimiques de micro-échantillons, par exemple pour déterminer les activités enzymatiques. Il convient de noter que lors de l’application de méthodes autres que l’AMHS , le volume d’hémolymphe pure peut être calculé indirectement, sur la base du volume de diluant d’hémolymphe dans un tube avant l’échantillonnage et du volume mesuré de diluant d’hémolymphe après l’échantillonnage. Cependant, une telle méthode peut entraîner des erreurs supplémentaires ; c’est pourquoi certains chercheurs utilisent des seringues de Hamilton . L’AMHS permet d’éviter les dépenses et le travail supplémentaire (par exemple, le débouchage des seringues, la désinfection, etc.) liés à l’utilisation des seringues de Hamilton.

La méthode de Mayack et Naug (l’hémolymphe est acquise en faisant tourner des abeilles aux antennes coupées) est similaire à l’AMHS. Cependant, leur méthode nécessite à la fois une centrifugeuse de laboratoire, et les pièces buccales des apidés devaient être collées pour éviter toute contamination possible. De plus, dans leur étude, ils ont disséqué les viscères des abeilles pour évaluer l’infection par Nosema ceranae avant de centrifuger les abeilles. Sans cette étape, les viscères seraient une source probable de contamination. Leur méthode consiste à placer les abeilles dans des tubes à centrifuger et à les faire tourner à 16 000 RCF pendant 30 secondes pour obtenir l’hémolymphe. Ce processus pourrait stratifier les composants de l’hémolymphe (par exemple, les protéines et les hémocytes) et comporte des risques accrus de contamination microbiologique et de mélanisation de l’hémolymphe (voir la discussion ci-dessus). Bien qu’elle puisse être idéale pour analyser les niveaux de sucre dans l’hémolymphe des abeilles butineuses dont les boyaux ont été retirés au préalable (comme dans leur étude), elle n’est pas tout à fait appropriée pour les études microbiologiques et génétiques ou les enquêtes sur les activités enzymatiques. Dans ce contexte, notre nouvelle méthode AMHS est plus adaptée à une utilisation générale, étant facile et simple, et probablement applicable dans un large éventail de différents types d’études.