La modulation allostérique fournit une avenue efficace pour l’inhibition sélective et puissante des enzymes. Ici, nous résumons et discutons de manière critique les avancées récentes sur les mécanismes des agonistes partiels allostériques pour trois enzymes de signalisation représentatives activées par les nucléotides cycliques : la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA), la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG) et la protéine d’échange activée par l’AMPc (EPAC). L’analyse comparative de l’agonisme partiel de la PKA, de la PKG et de l’EPAC révèle un thème émergent commun, à savoir l’échantillonnage d’états conformationnels « mixtes » distincts, soit au sein d’un seul domaine, soit entre des domaines distincts. Nous montrons ici comment ces états « mixtes » jouent un rôle crucial dans l’explication de la réponse fonctionnelle observée, c’est-à-dire l’agonisme partiel et la pluripotence allostérique, ainsi que dans la maximisation de l’inhibition tout en minimisant les pertes de puissance. En outre, en combinant la résonance magnétique nucléaire (RMN), les simulations de dynamique moléculaire (MD) et la modélisation allostérique d’ensemble (EAM), nous montrons également comment cartographier le paysage de l’énergie libre des ensembles conformationnels contenant des états « mixtes ». En discutant des études de cas sélectionnées, nous illustrons comment les simulations MD et l’EAM complètent la RMN pour relier quantitativement la dynamique des protéines à leur fonction. Les EAM basées sur la RMN et le MD qui en résultent devraient permettre d’éclairer non seulement la conception de nouvelles générations d’inhibiteurs allostériques hautement sélectifs, mais aussi le choix de combinaisons de médicaments multiples.