INTRODUCTION

Jogurt jest produktem mlecznym przygotowanym przez fermentację mleka z Lactobacillus spp. Obecnie, terapeutyczne, profilaktyczne i odżywcze właściwości jogurtu są szeroko akceptowane (Boor, 2001). Podawane w odpowiedniej ilości, probiotyki przynoszą korzyści zdrowotne gospodarzowi i zwiększają równowagę mikrobiologiczną (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Probiotyki są więc żywymi, niepatogennymi, przyjaznymi mikroorganizmami, które odgrywają korzystną rolę w składzie mikroflory gospodarza (Schrezenmeir i de Vrese, 2001). Bakterie kwasu mlekowego (LAB) są najważniejszą probiotyczną grupą mikroorganizmów, szczególnie Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. i Enterococcous sp. (Klein i in., 1998). Dietetyczne i terapeutyczne właściwości produktów mlecznych są determinowane przez mikroorganizmy probiotyczne (Boor, 2001).

Jogurt jest potencjalnym źródłem probiotycznych bakterii Lactobacillus spp. Jogurt jest również znany jako najbogatszy w probiotyki zanieczyszczający żywność. Wartość odżywcza produktów mlecznych jest zwiększana przez mikroorganizmy probiotyczne i metabolity powstające w wyniku fermentacji. Regularne spożywanie jogurtu zmniejsza nadmiar tłuszczu w wątrobie i zwiększa jego wydzielanie. Jest to również niezbędne dla osób cierpiących na choroby serca, miażdżycę, nadciśnienie i stany zapalne. Sok żołądkowy, który jest wydzielany pod wpływem działania jogurtu, prowadzi do wysokiej zdolności trawienia. Korzystny wpływ mikroorganizmów probiotycznych, zwłaszcza Lactobacillus sp., który istnieje w produktach mlecznych, które dowody zgłoszone ponadto, wielu badaczy badali wpływ mikroorganizmów probiotycznych przeciwko organizmom patogennym przy użyciu różnych metod (Mercenier et al., 2003).

Lactobacillus są członkami bakterii kwasu mlekowego, których podstawowym produktem końcowym fermentacji jest kwas mlekowy. Są to bakterie o dużym znaczeniu handlowym i szerokim zastosowaniu zarówno w przemyśle spożywczym jak i nie spożywczym ze względu na ich status „Ogólnie Uznany za Bezpieczny” (GRAS). Bakterie Lactobacillus były intensywnie badane pod kątem biologii molekularnej w celu poprawy ich specyficznych korzystnych właściwości (Pouwels i Leer, 1993).

Sposób działania probiotyków opiera się na zdolności bakterii probiotycznych do wiązania patogenów w tkance nabłonka jelitowego. Antypatogenne działanie probiotyków polega na wytwarzaniu kwasu mlekowego, który obniża pH, wchodzi w interakcje z toksynami produkowanymi przez patogeny z wytworzeniem nadtlenku wodoru i syntezą bakteriocyn (Corcionivoschi i in., 2010).

Skuteczne działanie produktu probiotycznego wymaga właściwej identyfikacji i charakterystyki zastosowanego gatunku bakterii. Wybór organizmów probiotycznych, które mogą być pomocne terapeutycznie i żywieniowo, opierałby się na określonych właściwościach (Fuller, 1989; Quewand i Vesterlund, 2004).

Celem tego badania było zebranie jogurtów z różnych regionów Bangladeszu i identyfikacja bakterii kwasu mlekowego (Lactobacillus) metodą bakteriologiczną, jak również specyficzną dla danego rodzaju PCR oraz analiza ich właściwości probiotycznych w następstwie zakłócenia wzrostu bakterii patogennych.

MATERIAŁY I METODY

Zbieranie próbek i izolacja bakterii kwasu mlekowego (Lactic Acid Bacteria – LAB): Dwa rodzaje próbek jogurtu zostały pobrane z różnych super sklepów w Chittagong i Bogra city w Bangladeszu, które były kwaśne (próbka M1, M2 i M3) i słodkie (próbka S2) w smaku. Próbki przechowywano bezpośrednio po pobraniu w lodówce w niskiej temperaturze (4°C) w sposób aseptyczny w celu ochrony przed skażeniem i zepsuciem. Z próbek jogurtów izolowano bakterie Lactobacillus spp. poprzez odpowiednie rozcieńczenie w 0,9% roztworze soli. Do hodowli użyto bulionu MRS (Man, Rogosa i Sharpe) oraz podłoża agarowego MRS (Man, Rogosa i Sharpe). pH pożywek zostało dostosowane do 6,5. Płytki inkubowano tlenowo w temperaturze 37°C przez 48 h. Na koniec izolowano pojedyncze kolonie Lactobacillus, obserwując morfologię kolonii oraz wykonując niektóre testy biochemiczne, takie jak barwienie metodą Grama, test katalazy i oksydazy. Dobrze wyizolowane kolonie pobierano i przenoszono do bulionu MRS w celu wzbogacenia bakterii Lactobacillus w temperaturze 37°C.

Identyfikacja bakterii kwasu mlekowego (LAB) za pomocą analizy bakteriologicznej: Identyfikację przeprowadzono zgodnie z metodami opisanymi w Bergeys manual of systemic bacteriology. Bez stosowania warunków beztlenowych wszystkie szczepy dobrze rosły na agarze MRS w temperaturze 37°C przez 48 h w celu selektywnego wyhodowania lactobacillusów. Z odpowiednich rozcieńczeń wybierano jedną reprezentatywną kolonię i wstępnie identyfikowano ją jako lactobacillus po reakcji barwienia metodą Grama, wyglądzie kolonii, morfologii komórek, teście katalazy, teście oksydazy, teście indolowym, teście czerwieni metylowej, teście Vogesa-proskauera, teście utylizacji cytrynianu i wzorcach fermentacji węglowodanów, zgodnie z podręcznikiem Bergeysa (Hensyl, 1994).

Ekstrakcja DNA z izolatów: DNA wyekstrahowano z 4 próbek wyizolowanych z jogurtu zgodnie z klasyczną metodą ciepło-rozmrażanie (Salehi i in., 2005). Czystą kulturę bakteryjną ze skosu agarowego MRS podhodowano w podłożu bulionowym MRS, z którego pobrano 1,5 mL hodowli bulionowej do probówki eppendorfskiej i wirowano przy 10 000 rpm przez 5 min. Po tym czasie supernatant wyrzucano, a osad zbierano. Do osadu dodano około 200 μl sterylizowanej w autoklawie wody dejonizowanej i rozpuszczono go przez potrząsanie palcem. Zakrętkę probówki eppendorfa przekłuwano sterylną igłą, a następnie probówkę gotowano w łaźni wodnej w temperaturze 100°C przez 10 minut. Tuż po gotowaniu probówkę eppendorfową trzymano w lodzie przez 10 min, a następnie wirowano przy 10.000 rpm przez 10 min. Następnie pobierano 100-150 μL supernatantu zawierającego bakteryjne chromosomalne DNA.

Amplifikacja PCR specyficzna dla rodzaju: W celu określenia przynależności do poziomu rodzajowego wszystkich 4 izolatów przeprowadzono PCR z użyciem zestawów primerów specyficznych dla rodzaju Lactobacillus: LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) i R16-1 (5′-CTTGTACACCG CCCGTCA-3′) zaprojektowanych przez Dubernet i wsp. (2002). Analizę PCR przeprowadzono w oparciu o region odstępu międzygenowego 16-23S rybosomalnego RNA, jak opisano wcześniej (Dubernet i in., 2002).

Mieszanina reakcyjna (20 μL) zawierała 1 μL (100 ng μL1) każdego primera dodanego z 10 μL 10× PCR Master Mix, 6 μL wody PCR i 2 μL szablonu. Warunkami przebiegu była wstępna denaturacja w 95°C przez 5 min, a następnie 30 cykli składających się z denaturacji w 95°C przez 30 s, annealingu w 55°C przez 30 s, przedłużenia w 72°C przez 30 s i końcowego etapu przedłużania w 72°C przez 7 min. Produkty przechowywano w temperaturze 4°C do czasu analizy. Wzmocnione produkty poddawano elektroforezie w 1% żelach agarozowych w buforze TAE (40 mM octan tris, 1 mM EDTA, pH 8,2). Żele barwiono bromkiem etydyny (5 μg mL1) i wizualizowano w transiluminatorze UV (Biometra GmBH, Niemcy).

Analiza cech probiotyków: Właściwości probiotyku określono poprzez analizę następujących testów.

Test tolerancji NaCl: W celu określenia tolerancji na NaCl wyizolowane bakterie Lactobacillus hodowano w bulionie MRS zawierającym dziewięć probówek, do których dopasowano różne stężenia NaCl (1-9%). Po autoklawowaniu przez 15 min pod ciśnieniem 15 Ibs w temperaturze 121°C, do każdej probówki wprowadzano 10 μL nocnej hodowli Lactobacillus i inkubowano beztlenowo w temperaturze 37°C przez 24 h. Po 24 h inkubacji wzrost bakterii mierzono za pomocą spektrofotometru przy długości fali 560 nm (Graciela i Maruia, 2001).

Test tolerancji na sól fizjologiczną: Szybkość wzrostu kultur bakteryjnych określano w bulionie MRS zawierającym różne poziomy (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 i 0,5%) soli żółciowych. Świeżo przygotowane hodowle inokulowano (1%) do podłoża i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h w warunkach beztlenowych. Następnie mierzono gęstość optyczną każdej próbki za pomocą spektrofotometru przy długości fali 560 nm (Graciela i Maruia, 2001).

Określanie optymalnego pH dla wzrostu: W celu określenia optymalnego pH dla wzrostu, 100 μL świeżej hodowli Lactobacillus overnight zaszczepiono do probówek zawierających bulion MRS o zmiennym pH w zakresie 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 i 8,0. Do określenia wpływu pH na wzrost użyto buforu octanowego (pH -4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5), buforu Tris-HCl (pH-7) i buforu boranowego (pH-8). Zaszczepiony bulion inkubowano w warunkach beztlenowych przez 24 h w temp. 37°C. Po inkubacji wzrost bakterii mierzono za pomocą spektrofotometru przy długości fali 560 nm w stosunku do bulionu kontrolnego bez inokulacji.

Oznaczanie kwasu organicznego i oznaczanie wartości pH: Według Hoque i wsp. (2010) przeprowadzono kwantyfikację kwasów organicznych produkowanych przez izolaty oraz oznaczanie ich wartości pH. Bulion MRS uzupełniony 10% mlekiem chudym zaszczepiono 1% (v/v) lub 100 μL hodowli nocnej izolatów i inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 72 h. Próbki po fermentacji pobierano co 24, 48 i 72 h, a płyny z koagulowanego mleka oddzielano przez filtrację. Po filtracji pH oddzielonej cieczy rejestrowano za pomocą pH-metru z elektrodą cyfrową, a kwantyfikacji kwasu organicznego dokonywano poprzez miareczkowanie 0,1 N NaOH z użyciem fenoftalenu jako wskaźnika pH (Hoque i in., 2010).

Badanie interferencji z bakteriami patogennymi: Aktywność przeciwbakteryjna wyizolowanych bakterii Lactobacillus spp, wobec niektórych bakterii patogennych została określona zmodyfikowaną metodą nakładania agaru (Aween i in., 2012). W badaniach wykorzystano osiem różnych patogenów człowieka: Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli i Shigella sonnei. Aktywność przeciwbakteryjną scharakteryzowano dodatkowo poprzez określenie czy jest ona bakteriostatyczna czy bakteriobójcza. Badanie przeprowadzono metodą wymazu z obszaru zahamowania wzrostu. Wymaz nanoszono na płytkę z agarem odżywczym i inkubowano tlenowo w temperaturze 37°C przez 72 h. Obecność wzrostu na płytce z agarem odżywczym interpretowano jako aktywność hamującą, tj. bakteriostatyczną, podczas gdy brak wzrostu interpretowano jako bakteriobójczy.

WYNIKI I DYSKUSJA

Identyfikacja bakterii poprzez testy bakteriologiczne i biochemiczne: Cztery izolaty wyhodowano na podłożu Man, Rogosa i Sharpe (MRS) o pH 6,5. Wszystkie izolaty były produkowane małe, nieregularne i okrągłe kształty z błyszczącym białawym kremem lub brązowawe kolorowe, które były morfologicznie podobne do Lactobacillus spp.

Wtedy wszystkie izolaty zostały zbadane pod mikroskopem jasnego pola, aby obserwować ich cechy mikroskopowe. Izolaty te okazały się gram dodatnie, krótkie i średnie pręciki w kształcie bakterii nie tworzących zarodników (Rys. 1a-d), co wskazuje, że są one członkami Lactobacillus spp.

W dodatku niektóre testy biochemiczne, takie jak test katalazy, test oksydazy, test indolowy, test czerwieni metylowej (MR), test Vogesa Proskauera (VP), test wykorzystania cytrynianu i wzory fermentacji węglowodanowej zostały wykonane zgodnie z wytycznymi podręcznika Bergeysa bakteriologii systematycznej (Hensyl, 1994).

Izolaty okazały się negatywne pod względem katalazy i oksydazy, a w testach IMViC (indol, czerwień metylowa, voges proskauar, wykorzystanie cytrynianu) wszystkie izolaty również okazały się negatywne, co może potwierdzać, że izolaty były Lactobacillus spp, 2010).

W tym badaniu, wszystkie cztery izolaty były zdolne do fermentacji 11 różnych węglowodanów, tj. glukozy, sacharozy, fruktozy, laktozy, ksylozy, rybozy, galaktozy, maltozy, mannitolu, ramnozy i dekstrozy, wskazując, że są one w stanie rosnąć w różnych siedliskach wykorzystujących różne rodzaje węglowodanów. Zestawienie wyników wszystkich testów bakteriologicznych i biochemicznych przedstawiono w tabeli 1. Wszystkie te wyniki są zgodne z wynikami Chowdhury et al. (2012).

Identyfikacja molekularna poprzez PCR swoisty dla rodzaju: W tym badaniu użyliśmy startera swoistego dla rodzaju, przygotowanego na podstawie analizy podobieństw między sekwencjami nukleotydów regionu odstępu między genami 16 i 23S rybosomalnego RNA bakterii Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). Specyficzność tego rodzajowo specyficznego primera w połączeniu z primerem uniwersalnym testowano wobec 23 szczepów Lactobacillus różnego pochodzenia. Produkty PCR poddano elektroforezie żelowej w 1% agarozie i wizualizacji w transiluminatorze UV. Dla każdej próbki (M1, M2, M3 i S2) znaleziono oczekiwane ostre pasmo o długości 200 bp, które odpowiada regionowi odstępu międzygenowego 16-23S rRNA Lactobacillus spp. Tak więc wszystkie 4 izolaty zostały potwierdzone na poziomie rodzaju jako Lactobacillus spp. Kontrola negatywna bez żadnego szablonu nie dała żadnego pasma, co sugeruje, że wszystkie 4 produkty PCR były korespondencją z szablonowym DNA (Rys. 2).

Analiza właściwości probiotyków: Bakterie probiotyczne produkują wiele substancji o właściwościach antybakteryjnych, w tym kwas organiczny, H2O2, bakteriocyny, które wpływają na metabolizm bakterii lub produkcję toksyn (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

Aby to zrobić, muszą być w stanie wytrzymać z niekorzystnymi warunkami w jelicie, takimi jak NaCl i sól żółci.

Test tolerancji na NaCl: Izolat Lactobacillus spp, z jogurtów był w stanie tolerować 1-9% NaCl. Aby określić tolerancję izolatów na NaCl, zmierzono gęstość optyczną przy 560 nm i wykreślono dane. Izolaty M1, M2, M3 i S2 dobrze rosły w 1% stężeniu NaCl. Maksymalny wzrost (OD) izolatów M1, M2, M3 i S2 w 1% NaCl wynosił odpowiednio 1,420, 2,143, 1,662 i 2,207 (Rys. 3). Wysoka tolerancja soli jest pożądaną właściwością dla organizmów, które mają być stosowane jako probiotyki.

Wiadomo, że NaCl jest substancją hamującą, która może hamować wzrost niektórych rodzajów bakterii. W tym badaniu wyniki wykazały, że Lactobacillus spp. wyizolowane z jogurtów były w stanie tolerować 1-9% NaCl, a optymalny wzrost obserwowano przy 1-5% NaCl (Hoque i in., 2010).

Test tolerancji soli żelaza: Wyizolowane Lactobacillus spp., były zdolne do przeżycia w 0,05, 0,1, 0,15 i 0,3% kwasie żółciowym. Wyizolowane Lactobacillus spp. były również zdolne do namnażania się w wyżej wymienionych stężeniach kwasu żółciowego. Gęstość optyczną zmierzono przy 560 nm, a dane wykreślono. Wszystkie izolaty dobrze rosną w 0,05% stężeniu soli żółci. Maksymalne przyrosty (OD) izolatów M1, M2, M3 i S2 wynosiły odpowiednio 1,741, 2,213, 1,758 i 2,125. Tempo wzrostu zmniejszało się wraz ze wzrostem stężenia soli żółci (ryc. 4).

W doświadczeniu zastosowano stężenie żółci 0,05-0,3%, które może występować w przewodzie pokarmowym człowieka, a maksymalne stężenie żółci występujące u zdrowego człowieka wynosi 0,3% (Graciela i Maruia, 2001). Podaje się, że przed wyborem bakterii probiotycznej do spożycia przez ludzi musi ona być tolerancyjna na 0,3% stężenie żółci (Gilliland i in., 1984). Na podstawie uzyskanych wyników sugeruje się, że szczepy te mogą być potencjalnie stosowane jako organizmy probiotyczne, ponieważ wszystkie izolaty były odporne i zdolne do wzrostu w 0,3% stężeniu soli żółciowych.

Określenie optymalnego pH dla wzrostu: Wyizolowane Lactobacillus spp, z jogurtów były zdolne do wzrostu w zakresie pH od 4,0-8,0. Gęstość optyczną mierzono przy 560 nm, a dane wykreślono. Maksymalny wzrost (OD) izolatów M1, M3 i S2 wynosił 2,201, 2,0619 i 2,237, odpowiednio przy pH 6,0, podczas gdy maksymalny wzrost izolatu M2 wynosił 2,259 przy pH 6,5 (Rys. 5). Izolaty były zdolne do wzrostu w pH pomiędzy 4,0 a 8,0, ale optymalny wzrost obserwowano przy pH pomiędzy 5,0 a 6,5 podczas hodowli w bulionie MRS w 37°C. Z tego badania można wywnioskować, że tempo wzrostu Lactobacillus spp. zmniejsza się na pewnym etapie, gdy wzrasta stężenie pH (Chowdhury et al., 2012).

Kwantyfikacja kwasu organicznego i oznaczanie wartości pH: Do ilościowego oznaczenia kwasu organicznego zastosowano metodę miareczkową.

Ilość kwasu organicznego = V×N×D

gdzie, V to objętość NaOH, N to moc NaOH, a D to współczynnik rozcieńczenia. Wyniki produkcji kwasu organicznego przedstawiono w tabeli 2.

Badania te wskazują, że produkcja kwasu organicznego wzrastała wraz z czasem inkubacji, ale jednocześnie pH pożywki obniżało się wraz ze wzrostem produkcji kwasu. Z wyników (Tabela 2) wynika, że najwyższą kwasowość (1,9%) i najniższe pH 3,64 zaobserwowano po 72 h inkubacji w 37°C dla bakterii probiotycznych Lactobacillus wyizolowanych z jogurtu Bogra. Inne bakterie probiotyczne wyizolowane z jogurtów z różnych supermarketów w Chittagong wykazały najwyższą kwasowość 1,83, 2,11 i 2,11% oraz najniższe pH 3,9, 3,68 i 3,65, odpowiednio po 72 h inkubacji.

Występuje niewielka zmienność w produkcji kwasu organicznego przez bakterie z rodzaju Lactobacillus ze względu na ich różnice regionalne, co wskazuje, że izolaty te są w niewielkim stopniu zależne od klimatu i środowiska (Hoque i in., 2010).

Badanie interferencji z bakteriami patogennymi: Probiotyki, w tym Lactobacillus, Bifidobacterium i Streptococcus spp. znane są z hamowania wzrostu szerokiej gamy patogenów jelitowych u człowieka. Oprócz korzystnych efektów przeciwko chorobom spowodowanym brakiem równowagi mikroflory jelitowej, Dunne i inni (2001) oraz Wollowski i inni (2001) donoszą o kilku eksperymentalnych obserwacjach bakterii przeciwko rozwojowi nowotworów jelita grubego.

W niniejszej pracy wybrane 4 izolaty były badane pod względem ich aktywności przeciwbakteryjnej wobec różnych bakterii patogennych, takich jak Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli i Shigella sonnei związanych z chorobami przenoszonymi drogą pokarmową. Porównanie ich inhibicji (w mm) wobec 8 patogenów testowych przedstawiono w tabeli 3.

Wyniki badań eksperymentalnych wykazały, że najwyższą aktywność inhibicyjną izolatu M1 wykazano wobec Bacillus cereus (51,20±1,22 mm), a najniższą strefę inhibicji (23,46±1,00 mm) wobec Shigella sonnei po 72 h inkubacji. Największą średnicę strefy zahamowania wzrostu izolatu M2 wykazano wobec E. coli (38,43±1,00 mm), a najmniejszą (20,10±1,00 mm) wobec Bacillus megaterium po 72 h inkubacji. Podobnie, największą średnicę strefy zahamowania wzrostu izolatu M3 wykazano wobec P. aeruginosa (42,90±1,20 mm), a najmniejszą (17,83±1,10 mm) wobec S. aureus. Wreszcie w izolacie S2 po 72 h inkubacji najwyższą strefę zaobserwowano wobec E. coli (43,80±1,20 mm), a najniższą (21,63±1,10 mm) wobec S. aureus. Wyniki odnoszące się do Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae i Escherichia coli okazały się adekwatne do wyników Chowdhury i wsp. (2012).

W obecnych badaniach izolaty M1, M2, M3 i S2 wykazały zadowalające wyniki dotyczące aktywności bakteriobójczej i bakteriostatycznej. Izolat M1 działał bakteriobójczo na Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei oraz bakteriostatycznie na Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus i E. coli. Izolat M2 był bakteriobójczy dla Bacillus cereus, Shigella sonnei i bakteriostatyczny dla Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli. Izolat M3 działał bakteriobójczo na Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium i Staphylococcus aureus oraz bakteriostatycznie na Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli i Shigella sonnei, a izolat S2 był bakteriobójczy dla Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae i Shigella sonnei oraz bakteriostatyczny dla Bacillus megaterium i Escherichia coli.

Podsumowanie

W niniejszym badaniu Lactobacillus spp, zostały wyizolowane i zidentyfikowane z selektywnych jogurtów regionalnych. W celu identyfikacji bakterii wykonano szereg testów bakteriologicznych i biochemicznych. Ponadto, w celu potwierdzenia identyfikacji bakteryjnej, przeprowadzono PCR z użyciem starterów specyficznych dla danego rodzaju (LbLMA-rev) oraz uniwersalnego (starter R16-1) odpowiadającego regionowi 16-23S rRNA odstępu międzygenowego Lactobacillus spp. Wyizolowane szczepy Lactobacillus spp. były zdolne do tolerowania substancji hamujących, takich jak NaCl (1-9%) i sól żółciowa (0,05-0,3%), a także zdolne do przeżycia w warunkach alkalicznych (pH 8,0). Wszystkie te izolaty (M1, M2, M3 i S2) były zdolne do wykorzystania węglowodanów takich jak glukoza, ksyloza, sacharoza, fruktoza, galaktoza, laktoza, maltoza, ryboza, ramnoza, mannitol i dekstroza. Ponadto, wyizolowane Lactobacillus spp. ze wszystkich 4 izolatów (M1, M2, M3 i S2) były zdolne do wytwarzania kwasu organicznego w mleku. Badanie to wskazuje, że istnieje niewielkie zróżnicowanie w produkcji kwasów organicznych przez Lactobacillus ze względu na ich regionalne zróżnicowanie. Stwierdzono zadowalającą aktywność przeciwbakteryjną wszystkich 4 izolatów (M1, M2, M3 i S2) wobec ośmiu powszechnie występujących bakterii chorobotwórczych człowieka, a izolaty wytwarzają bakteriocyny pozakomórkowo. Probiotyk musi być zdolny do hamowania rozwoju organizmów patogennych i powinien być w stanie tolerować trudne warunki panujące w jelitach człowieka, takie jak wysokie zasolenie, niskie pH i wysokie stężenie soli żółciowych. Wszystkie wyizolowane szczepy Lactobacillus spp. spełniły te kryteria, dlatego mogą być uznane za potencjalne probiotyki dla zdrowia człowieka.