Produkcja katalazy jest uważana za determinantę wirulencji u Staphylococcus aureus, pozwalającą bakteriom na lepszą odporność na wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe zabijanie przez nadtlenek wodoru (4, 5). Gatunki Staphylococcus są katalazo-dodatnie i fakultatywnie beztlenowe, z wyjątkiem S. aureus subsp. anaerobius i S. saccharolyticus, które są katalazo-dodatnie i beztlenowe. Ten ostatni jest ogólnie uważany za apatogenny. Katalaza S. aureus jest kodowana przez gen katA, który ma 1,518-bp otwartą ramkę odczytu i koduje białko o długości 505 aminokwasów (9). S. aureus subsp. anaerobius posiada zmutowany gen, oznaczony jako katB, który ma długość 1,368 bp i koduje polipeptyd o długości 455 aminokwasów. W porównaniu do sekwencji nukleotydowej katA, sekwencja katB wykazała sześć mutacji typu missense oraz delecję pojedynczej pary zasad, zlokalizowaną przy bp 1338 w górę od kodonu inicjacyjnego, co powoduje przesunięcie ramki odczytu nukleotydów i przedwczesne zakończenie translacji przy bp 1368 (9).

Zanotowano występowanie beztlenowych, katalazoujemnych szczepów S. aureus. Żaden z nich nie został jednak scharakteryzowany metodami molekularnymi (1, 2, 7, 10, 12). Opisujemy tutaj izolat metycylinoopornego S. aureus (MRSA), który został scharakteryzowany poprzez amplifikację i sekwencjonowanie genu katalazy. Według naszej wiedzy jest to pierwszy molekularny opis katalazoujemnego szczepu S. aureus subsp. aureus.

65-letni mężczyzna został przyjęty na oddział intensywnej terapii oddziału chirurgii Szpitala Uniwersyteckiego w Moguncji. Był on obciążony wieloma chorobami, cierpiał na alkoholową marskość wątroby, nadciśnienie tętnicze, chorobę wieńcową, niewydolność serca (klasa II według klasyfikacji New York Heart Association), cukrzycę i przewlekłą obturacyjną chorobę płuc. Próbka wydzieliny z tchawicy została pobrana do rutynowego badania mikrobiologicznego, bez widocznych w tym czasie oznak jakiejkolwiek infekcji.

Próbka wydzieliny z tchawicy została przetworzona w konwencjonalny sposób, a na 5% agarze z krwią owczą zaobserwowano kremowe kolonie beta-hemolityczne, typowe dla S. aureus. Izolat wielokrotnie wykazywał negatywny wynik testu na katalazę po inkubacji tlenowej lub beztlenowej, nawet przy piątej podhodowli. Dobrze rósł zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Wyniki testu koagulazowego i testu DNazowego były silnie pozytywne. System BBL CRYSTAL dla bakterii Gram-dodatnich (Becton Dickinson Company, Sparks, MD) oraz system API Staph (bioMérieux, Marcy l′Etoile, Francja) zidentyfikowały izolat jako S. aureus z prawdopodobieństwem odpowiednio 98,6% i 97,8% (kody profili 0064773465 i 6736153). Analiza sekwencji DNA genu 16S rRNA potwierdziła, że szczep jest S. aureus subsp. aureus. Szczep ten został zdeponowany w DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) pod numerem DSM 18827.

Wrażliwość na antybiotyki określono metodą dyfuzyjno-krążkową na agarze Mueller-Hinton w oparciu o wytyczne CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Szczep był oporny na penicylinę, oksacylinę, cefaklor, cefuroksym, erytromycynę, klindamycynę i ciprofloksacynę, ale wrażliwy na gentamycynę, rifampinę, sulfametoksazol-trimetoprim, wankomycynę, teikoplaninę i linezolid. Jest to typowy fenotyp endemicznych szczepów MRSA obserwowanych w naszym ośrodku. Szczep został dalej potwierdzony jako MRSA przez zastosowanie PCR w celu identyfikacji mecA i genów specyficznych dla S. aureus, jak opisano wcześniej (6).

Sekwencja nukleotydowa genu katalazy S. aureus w katalazoujemnym szczepie MRSA została amplifikowana przez PCR przy użyciu starterów opisanych wcześniej (9), a obie nici zostały zsekwencjonowane przy użyciu chemii terminatora barwnika w analizatorze DNA ABI PRISM 3700. Analiza sekwencji wykazała 99,60% identyczność z genem katalazy katA szczepu MRSA Mu50 lub N315 (Gen Bank accession no. odpowiednio BA000017 lub BA000018), z różnicą 6 nukleotydów w pozycjach 1152 i 1388 do 1392 w górę od kodonu inicjacji. Substytucja jednobazowa (T) zlokalizowana w bp 1152 upstream od kodonu inicjacyjnego była mutacją cichą. Natomiast delecja pięciu zasad (AAACG) (bp 1388 do 1392 w górę od kodonu inicjuj±cego) prowadziła do przesunięcia ramki odczytu nukleotydów, a w konsekwencji do zamiany kolejnych aminokwasów i przedwczesnej terminacji translacji w bp 1418. Podobnie, nasza sekwencja genu katalazy była w 99,54% identyczna z sekwencjami katA szczepów S. aureus subsp. aureus MSSA476, COL, NCTC 8325, USA300 i MW2, których kompletne genomy również sekwencjonowano, z wielokrotnym potwierdzeniem tej samej 5-bazowej delecji.

Mutacja ta różniła się więc zasadniczo od mutacji, które zostały opisane dla genu katalazy katB katalazoujemnych szczepów S. aureus subsp. anaerobius (GenBank accession No. AJ000471) (9). Jednakże, konsekwencje delecji w C-końcowym regionie katalazy wydawały się być takie same, tj. przesunięcie ramki odczytu nukleotydów, wczesny kodon terminacji i utrata aktywności enzymatycznej.

Dwa gatunki Staphylococcus, S. aureus subsp. anaerobius i S. saccharolyticus, są znane z tego, że nie wytwarzają katalazy. Nasz szczep różni się od tych gatunków na podstawie zdolności do dobrego wzrostu w warunkach tlenowych, ekspresji czynnika krzepnięcia, produkcji kwasu z trehalozy i laktozy oraz sekwencji 16S rRNA.

Katalazy, lub bardziej poprawnie, hydroperoksydazy, są enzymami zaangażowanymi w degradację nadtlenku wodoru (wytwarzanego podczas metabolizmu komórkowego lub napotkanego podczas infekcji gospodarza) do wody i tlenu cząsteczkowego. Katalaza jest od dawna uważana za czynnik warunkujący wirulencję S. aureus. Znaczenie ekspresji in vivo enzymów stresu oksydacyjnego katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej zostało zasugerowane poprzez analizę izolatów klinicznych z obniżonym poziomem ekspresji tych enzymów (4, 5). S. aureus subsp. anaerobius jest bardzo blisko spokrewniony z S. aureus sensu stricto i dzieli z nim zdolność do produkcji zewnątrzkomórkowych toksyn i enzymów, ale jest obdarzony znacznie niższym potencjałem patogennym niż S. aureus (9). Zarówno przeżycie wewnątrzkomórkowe jak i namnażanie zewnątrzkomórkowe odgrywają ważną rolę w patogenezie zakażeń S. aureus. Wewnątrzkomórkowe przeżycie w neutrofilach, komórkach śródbłonka, komórkach nabłonka i osteoblastach zostało opisane jako występujące u S. aureus i tym samym wymaga, aby bakterie mogły wytrzymać stres oksydacyjny (3). Katalaza jest składnikiem krytycznym dla utrzymania żywotności podczas długotrwałego głodzenia, co jest ważne w przypadku szpitalnego przenoszenia S. aureus lub MRSA (11). Wreszcie, wytwarzanie katalazy jest ważnym mechanizmem umożliwiającym S. aureus współistnienie z mikroorganizmami wytwarzającymi nadtlenek wodoru w środowisku tlenowym, takim jak górne drogi oddechowe. Bakteriobójcza aktywność Streptococcus pneumoniae wobec S. aureus jest najwyraźniej pośredniczona przez nadtlenek wodoru, dostarczając możliwego mechanistycznego wyjaśnienia interferencji międzygatunkowej obserwowanej w badaniach epidemiologicznych (8).

Kliniczne znaczenie katalazoujemnych szczepów S. aureus wymaga badań. W poprzednich doniesieniach, katalazoujemne szczepy S. aureus były izolowane z próbek krwi, cewników, próbek wydzieliny oskrzelowej, owrzodzeń i innych ran związanych z infekcjami lub endemitami szpitalnymi (1, 2, 7, 10, 12). Chociaż jest ich niewiele, doniesienia te dostarczają dowodów na to, że katalaza nie jest bezwzględnym warunkiem patogenności. Możliwe jest jednak, że patogenność lub efektywność przenoszenia jest zmniejszona. W naszym przypadku szczep MRSA ujemny w stosunku do katalazy był wielokrotnie izolowany od tego samego pacjenta, ale nigdy od innych pacjentów oddziału intensywnej terapii lub szpitala uniwersyteckiego. Nic nie wskazywało na to, że szczep ten wywołał zakażenie. Wzorzec oporności na antybiotyki sugerował wspólne pochodzenie szczepu katalazoujemnego MRSA i innych lokalnych szczepów MRSA. Istnieje niewiele, jeśli w ogóle, doniesień o katalazoujemnym MRSA, który został wyizolowany od pacjenta bez widocznej choroby wywołanej przez izolat. Niniejsza praca przedstawia wyjątkowe doniesienie w tym zakresie. Jest to również pierwsze doniesienie o katalazo-ujemnym szczepie S. aureus subsp. aureus scharakteryzowanym metodami molekularnymi.