Model dyskretny

Wzrost kolonii mikroorganizmów zużywających dyfundujący składnik odżywczy jest reprezentowany przy użyciu modelu kratowego wprowadzonego przez Matsuurę23, którego szczegóły są podane w rozdziale 3. W skrócie, rozważamy prostokątną siatkę z L x i L y miejscami, odpowiednio w kierunkach x i y. Liczba zajętych komórek oznaczana jest jako ν, a odpowiadająca jej gęstość komórek ρ = ν/(L x L y ). Każdy element prostokątnej siatki może zawierać co najwyżej jedną komórkę, ale może pomieścić dowolną nieujemną całkowitą liczbę cząsteczek substancji odżywczych, niezależnie od tego, czy w danym miejscu znajduje się komórka. W każdym kroku czasowym komórki drożdży mogą wchłonąć cząsteczkę substancji odżywczej znajdującą się w tym samym miejscu i wytworzyć pojedynczą komórkę potomną w sąsiednim miejscu w kierunku kardynalnym, podczas gdy cząsteczki substancji odżywczej mogą wykonać s kroków, również w kierunkach kardynalnych. Jako warunek początkowy, komórki są wysiewane w obrębie siatki w określonym wzorze, podczas gdy pewna liczba cząstek substancji odżywczych jest umieszczana równomiernie losowo w domenie, aby uzyskać określoną średnią początkową koncentrację c0. Granice domeny są traktowane jako lite ściany, replikując zachowanie eksperymentalne w szalce Petriego. Co ważne, wzory produkowane przez ten model są wynikiem interakcji pomiędzy komórkami i samą pożywką, tak więc wszelkie niejednolite morfologie produkowane przez model mogą być przypisane w całości DLG.

Charakterystyczne morfologie DLG

Matsushita & Fujikawa12 wykorzystał kolonię komórek B. subtilis do zilustrowania trzech kluczowych zjawisk zachodzących w DLG: (I) „przesiewanie” krótszych gałęzi przez dłuższe; (II) odpychanie między sąsiednimi koloniami; oraz (III) wzrost ukierunkowany na źródło składników odżywczych (Rys. 2). Wcześniej wykazano, że te cechy wynikają z samego DLG przy użyciu modelu wzrostu kolonii opartego na siatce, podobnego do tego zastosowanego tutaj30. Najpierw potwierdzamy, że opisany powyżej model dyskretny może odtworzyć to zachowanie, zanim użyjemy tego modelu do ilościowej oceny wytworzonych wzorców.

Wyniki eksperymentalne Matsushita & Fujikawa12 (górny rząd) z odpowiadającymi im symulacjami modelu (dolny rząd). Pokazane są (a) większe gałęzie odgradzające mniejsze od pożywki (zjawisko I), (b) dwie kolonie zasiane blisko siebie, które się odpychają (zjawisko II) i (c) pojedyncza kolonia rosnąca w kierunku źródła pożywki po prawej stronie płytki Petriego (zjawisko III). Symulacje (d) gałęzi ekranujących, (e) dwóch kolonii w bliskim sąsiedztwie i (f) wzrostu z pożywką po prawej stronie są obliczone przy użyciu modelu kratowego. Komórki nasienne są zaznaczone czerwoną kropką. Symulacje zostały obliczone na siatkach o wymiarach L x = L y = 200 z parametrami s = 3 i c0 = 1, co daje wartość Δ tego samego rzędu wielkości co w eksperymentach. Rysunki 2(a), 2(b) i 2(c) są przedrukowane z Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita i Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, za zgodą Elsevier.

Oddziaływanie pomiędzy komórkami i substancją odżywczą może być szeroko kwantyfikowane przez porównanie względnej szybkości rozprzestrzeniania się tych dwóch wielkości. Wzrost kolonii mierzy się obliczając średnie tempo zmian powierzchni kolonii Δ m widzianej z góry, które ma te same jednostki co dyfuzyjność. Wielkość tę można łatwo obliczyć z obrazu doświadczalnego lub z danych symulowanych, takich jak te uzyskane z modelu dyskretnego. Za rozprzestrzenianie się składnika odżywczego Δ n przyjmuje się dyfuzyjność glukozy, ponieważ jest ona powszechnie stosowana jako źródło składnika odżywczego, a różnica pomiędzy dyfuzyjnością różnych składników odżywczych jest niewielka. Na podstawie obserwacji doświadczalnych wiadomo, że dyfuzyjność glukozy w wodzie wynosi około \({D}_{0}=4,03 razy {10}^{-2}}) mm2 min-136. Dla glukozy w żelu agarowym o małej gęstości dyfuzyjność jest dana wzorem

gdzie w jest procentem wagowym agaru37. Przy założeniu, że w = 0,3%, dyfuzyjność wynosi 4,01×10-2 mm2 min-2, co jest wartością używaną w pozostałej części tego opracowania. Dyfuzyjność zmienia się w niewielkim stopniu wraz z ilością agaru, a zatem w ma pomijalny wpływ na wyniki. Na podstawie tych wielkości obliczamy stosunek

który stanowi bezwymiarową miarę względnego tempa rozprzestrzeniania się. Przy małych wartościach Δ, substancja odżywcza dyfunduje w szybszej skali czasowej niż wzrost komórek, co oznacza, że wszelkie lokalne zmiany stężenia substancji odżywczej będą rozpraszane bez wpływu na morfologię kolonii. Wartość Δ równa 1 lub większa wskazuje, że wzrost komórek zachodzi z szybkością co najmniej tak dużą, jak dyfuzja substancji odżywczych, a lokalne zmiany stężenia substancji odżywczych mogą mieć wpływ na morfologię kolonii. Spośród trzech obrazów eksperymentalnych, tylko obraz ukierunkowanego wzrostu posiada wystarczającą informację zarówno o skali jak i czasie potrzebnym do obliczenia Δ. Na podstawie tego obrazu stwierdzamy, że Δ ≈ 0.23. Ustawienie s = 3 i c0 = 1 w modelu daje rozwiązania z wartościami Δ pomiędzy 0.3 i 0.5, co jest tego samego rzędu wielkości co wyniki eksperymentalne, a więc stanowi odpowiednie porównanie. Te wartości parametrów są używane w pozostałej części tego podrozdziału. Zachowanie w każdym z trzech przypadków jest dalej kwantyfikowane za pomocą indeksów przestrzennych, opisanych poniżej, podobnie do podejścia Binder et al.38. Każda symulacja wykorzystuje siatkę o wymiarach L x = L y = 200, która jest wystarczająco duża, aby uzyskać cechy z wystarczającą rozdzielczością, będąc jednocześnie wydajną obliczeniowo.

Aby zbadać ekranowanie gałęzi (zjawisko I), składniki odżywcze są rozsiewane równomiernie losowo w całej domenie, a pojedyncza komórka jest umieszczana w centrum siatki. Symulacja jest prowadzona do momentu, gdy całkowita gęstość komórek osiągnie wartość 0.2, co ilustruje reprezentatywna kolonia pokazana na Rys. 2. Kolonia ta charakteryzuje się dużymi odgałęzieniami wychodzącymi z miejsca początkowej centralnej komórki, z krótszymi odgałęzieniami pomiędzy nimi, które zostały odizolowane od składników odżywczych przez większe odgałęzienia, i wykazuje znaczący nierównomierny wzrost. Odpowiada to zachowaniu zaobserwowanemu przez Matsushita & Fujikawa12. Morfologia może być określona ilościowo przez pierwsze liczenie kątów do każdej komórki mierzonych przeciwnie do ruchu wskazówek zegara od jakiegoś kąta odniesienia z początkiem umieszczonym w środku masy. Zliczenia są skalowane przez wartości oczekiwane dla komórek rozmieszczonych równomiernie w sposób losowy, a indeks kątowy niejednolitego wzrostu I θ jest definiowany jako odchylenie standardowe skalowanych zliczeń, tak że większe wartości I θ wskazują na większy poziom niejednolitego wzrostu. Obraz doświadczalny ma indeks 0.18, podczas gdy symulacja ma indeks 0.2, wskazując, że oba są w bliskiej zgodzie.

Dla przypadku kolonii odpychających (zjawisko II), pożywka jest ponownie umieszczona równomiernie w sposób losowy w całej domenie. Dwie komórki nasienne są umieszczone pionowo w środku domeny, każda w odległości jednej ósmej szerokości domeny od środka w poziomie, tak aby komórki były oddzielone o jedną czwartą całkowitej szerokości domeny. Symulacja jest obliczana do momentu, gdy całkowita gęstość komórek osiągnie wartość 0,2. Typowa symulacja pokazana jest na Rys. 2, na którym widać przerwę między dwoma koloniami zaobserwowanymi przez Matsushitę & Fujikawę12. Kolonie odpychające mogą być określone ilościowo poprzez policzenie całkowitej liczby komórek ν oraz liczby komórek ν c pomiędzy dwoma komórkami nasiennymi na końcu symulacji. Indeks odpychania definiuje się wtedy jako I c = 1 – ν c /ν, który jest bliski 0.5, gdy dwie kolonie rosną równomiernie, mniejszy niż 0.5, gdy tworzy się luka, i większy niż 0.5, gdy kolonie wykazują preferencję do wzrostu ku sobie. Położenie komórek nasiennych dla każdej kolonii w obrazie doświadczalnym jest aproksymowane przez narysowanie linii wzdłuż gałęzi i zidentyfikowanie miejsc ich przecięcia. Obraz eksperymentalny i symulacja mają indeksy odpowiednio 0,19 i 0,27, co sugeruje, że obie produkują podobne wzorce wzrostu ze znaczną różnicą między dwiema koloniami.

Rozwój ukierunkowany (zjawisko III) jest symulowany przez początkowe umieszczenie wszystkich składników odżywczych w najbardziej prawej kolumnie domeny, z pojedynczą komórką umieszczoną w środku domeny. Symulacja jest następnie obliczana do momentu, gdy gęstość komórek osiągnie wartość 0.1. Typową kolonię pokazano na Rys. 2, która jest bardzo podobna do wyników eksperymentalnych Matsushity & Fujikawy12. Aby zmierzyć stronniczość w kierunku jednej strony domeny, obliczamy proporcję I b komórek po prawej stronie domeny w stosunku do całkowitej liczby komórek, tak że I b ∈ . Wartości indeksu I b bliskie 0.5 wskazują na małą tendencyjność, podczas gdy I b < 0.5 wskazuje na tendencyjność w kierunku prawej strony, a I b < 0.5 wskazuje na tendencyjność w kierunku lewej strony. Obraz eksperymentalny ma indeks 0.92, który ściśle pokrywa się z indeksem symulacji 0.93. W obu przypadkach indeksy wskazują na dużą tendencję wzrostu w kierunku początkowej lokalizacji pożywki.

Jak stwierdzili Ginovart et al.30, dobre jakościowe dopasowania pomiędzy obrazami doświadczalnymi i symulacjami pokazują, że DLG sama może wytworzyć przesiewanie, odpychanie i ukierunkowany wzrost kolonii B. subtilis. My dodatkowo wzmocniliśmy to porównanie poprzez zastosowanie porównania ilościowego pomiędzy eksperymentami i modelem matematycznym. W ten sposób oczekujemy, że te zjawiska będą obecne, gdy DLG wpływa na morfologię, podczas gdy brak tych cech sugeruje, że inne mechanizmy są odpowiedzialne za wzór wzrostu. Co istotne, zgodność pomiędzy modelem dyskretnym a modelem zaproponowanym przez Ginovart et al. pokazuje, że zastosowany tutaj model dyskretny zapewnia zadowalającą reprezentację DLG, a zatem może być użyty do ilościowej oceny tego zachowania.

Wywoływanie DLG

Po wykazaniu, że model dyskretny jest w stanie odwzorować zachowanie DLG, określamy tutaj ilościowo zależność tych zjawisk od parametrów modelu, aby przewidzieć, kiedy pojawią się efekty DLG. Kolonie są ponownie symulowane na siatce o wymiarach L x = L y = 200 przy użyciu tych samych trzech warunków początkowych i kryteriów zatrzymania jak w poprzednim podrozdziale. Symulacje są powtarzane 50 razy dla każdej pary kroków odżywczych s = 1, 5, …, 37 i początkowych stężeń c0 = 1, 2, …, 7. Dla każdej pary parametrów obliczamy odpowiedni średni indeks w 50 realizacjach.

Aby zbadać przesiewanie rozgałęzień (zjawisko I), rozważamy kolonie wyrosłe z pojedynczej komórki w jednolitym polu odżywczym, z odpowiadającymi im wartościami średniego indeksu \({{Bar{I}}_{theta }} w 50 realizacjach pokazanych na Rys. 3. Największe wartości indeksu \({bar{I}}_{theta }} powstają, gdy zarówno s jak i c0 są małe, co wynika z dwóch czynników. Po pierwsze, ponieważ dyfuzyjność składników odżywczych, efektywnie s, jest mała w stosunku do szybkości wzrostu komórek, fluktuacje poziomów składników odżywczych pojawiają się w całej domenie. Po drugie, niskie początkowe stężenie substancji odżywczych c0 oznacza, że te fluktuacje tworzą regiony, w których poziom substancji odżywczych jest zbyt niski, aby wspierać wzrost komórek. Gdy s lub c0 jest większe, przynajmniej jeden z tych warunków nie może wystąpić, a wartość \u200 \u200 \u200 \u200 \u200 staje się mniejsza, wskazując, że DLG nie ma już znaczącego wpływu na kolonię. Tak więc, wyniki te wskazują, że niejednolite wzory mogą wystąpić tylko wtedy, gdy zarówno dyfuzyjność składnika odżywczego, w stosunku do szybkości wzrostu komórek, jak i stężenie składnika odżywczego są małe.

Pomiary efektów DLG w symulowanych koloniach mikroorganizmów. Wszystkie symulacje zostały obliczone przy użyciu modelu kratowego z zastosowaniem szeregu kroków odżywczych s i początkowych stężeń składników odżywczych c0. Pokazano (a) średni indeks \({bar{I}}_{theta }} dla przesiewania gałęzi (zjawisko I), (b) średni indeks \({bar{I}}_{c}} dla odpychania kolonii (zjawisko II) i (c) średni indeks \({bar{I}}_{b}} dla ukierunkowanego wzrostu (zjawisko III).

Podobne zachowanie obserwuje się dla przypadku odpychania (zjawisko II), co widać na podstawie średniego indeksu \({bar{I}}_{c}} wykreślonego na Rys. 3. Największe wartości indeksu występują przy małych wartościach s i c0, co zachodzi z tych samych powodów co dla \({bar{I}}_{theta}).

Zachowanie dla wzrostu ukierunkowanego (zjawisko III) jest inne, co widać na podstawie średniego indeksu \({bar{I}}_{b}) przedstawionego na Rys. 3. Przy małych wartościach s, indeks \({bar{I}}_{b}) jest duży i niewiele zmienia się z c0. Wraz ze wzrostem s, indeks \({bar{I}}_{b}} maleje i wykazuje większą zależność od c0, z większymi wartościami \({bar{I}}_{b}}) przy niższym c0. Zakres wartości parametrów, w którym można zaobserwować ukierunkowany wzrost jest znacznie większy niż dla dwóch pozostałych zjawisk DLG. Dlatego też, jeśli skierowany wzrost nie występuje, to nie wystąpią również dwie pozostałe cechy, a zatem skierowany wzrost stanowi użyteczne pierwsze sprawdzenie DLG, które jest proste do zmierzenia. Ta cecha będzie używana do testowania DLG w pozostałej części tej pracy.

Model kontinuum

Występowanie zjawisk DLG zależy zarówno od koncentracji składników odżywczych jak i dyfuzyjności dwóch gatunków. Podczas gdy wskaźniki mierzą zależność tych zjawisk od liczby dyskretnych kroków pożywki s i początkowego stężenia pożywki c0, wartość Δ mogła być jedynie obliczona z danych symulacyjnych, a nie określona jako wejście do modelu. Jednak w przypadku danych doświadczalnych, naturalnym jest scharakteryzowanie względnego rozprzestrzeniania się komórek i pożywki za pomocą Δ, ponieważ może to być łatwo zmierzone na podstawie obrazów doświadczalnych. Wprowadzamy tutaj deterministyczny układ równań reakcja-dyfuzja, który modeluje gęstość komórek i stężenie substancji odżywczej oraz pozwala na określenie względnej dyfuzyjności każdej z tych wielkości, co jest równoważne określeniu Δ. Chociaż model ten nie jest odpowiedni do uchwycenia drobnych cech obserwowanych na Rys. 2, jest on w stanie odtworzyć ukierunkowany wzrost w kierunku źródła substancji odżywczej (zjawisko III), które pojawiło się w największym zakresie parametrów. Skupiamy się zatem na tym aspekcie DLG, który działa jako łatwo mierzalny znak, że DLG ma miejsce.

Rozważamy jednowymiarową domenę, która jest wystarczająca do zilustrowania ogólnego zachowania modelu29,32,39. Wykorzystując bezwymiarowe położenie x, czas t, gęstość komórek n(x,t) i stężenie pożywki g(x, t), opisane w sekcji 3, równania rządzące sprowadzają się do

Parametr D = D m /D n jest stosunkiem dyfuzyjności komórki D m do dyfuzyjności składnika odżywczego D n . Jest on podobny do definicji Δ (2), przy czym dyfuzyjność komórek zastępuje mierzone tempo zmian powierzchni kolonii. Pierwszy człon po prawej stronie obu równań reprezentuje udział dyfuzji, podczas gdy drugie członki reprezentują odpowiednio zużycie substancji odżywczej i wzrost nowych komórek, przy czym c jest bezwymiarową ilością substancji odżywczej zużytej na jedną nową komórkę.

Jako warunki początkowe, komórki umieszcza się w środku domeny z substancją odżywczą skierowaną w prawo zgodnie z

gdzie N może być interpretowane jako bezwymiarowa koncentracja substancji odżywczych. Aby zilustrować ogólne zachowanie, warunki początkowe dla N = 1 są pokazane na Rys. 4.

Wyniki jednowymiarowego modelu reakcja-dyfuzja. (a) Warunek początkowy dla N = 1 pokazuje komórki skupione w centrum domeny z substancją odżywczą po prawej stronie. (b) Maksymalne wartości I b do czasu t = 1, wykreślone względem logarytmu bazowego 10 z D i N, sugerują, że DLG występuje tylko przy określonych wartościach parametrów. Dwa reprezentatywne przykłady są zaznaczone. (c) Przy największej wartości I b, gdy D = 10-6 i N = 1, komórki są nadal prawie symetryczne wokół x = 0, podczas gdy stężenie substancji odżywczych stało się efektywnie jednorodne. (d) Użycie D = 10-0.5 i N = 105 powoduje znaczne odchylenie w kierunku prawej strony, gdzie pożywka była początkowo skoncentrowana.

Przyjmując typowe wartości parametrów podane w rozdziale 3 jako stałe, wartość N zmienia się tylko ze względu na fizyczne stężenie pożywki. Biorąc pod uwagę pożywkę zawierającą tylko składnik odżywczy, reprezentujący maksymalne stężenie, stwierdzamy, że wartość N nie może być większa niż około 105. Rozwiązania są więc obliczane dla 1 ≤ N ≤ 105. Podczas gdy typowe obserwacje doświadczalne sugerują, że 10-3 ≤ D ≤10-1, my rozważamy wartości dla 10-6 ≤ D ≤103, aby teoretycznie zbadać, jak zachowanie zmienia się wraz z D. Dla różnych wartości tych parametrów obliczamy maksymalną wartość I b obserwowaną do czasu t = 1. Odpowiada to w przybliżeniu 119 dniom wzrostu, co jest wartością większą niż typowe czasy eksperymentalne, ale zapewnia, że maksymalna wartość I b jest obserwowana podczas symulacji. Obliczone indeksy I b są wykreślone na Rys. 4 przy użyciu skali logarytmicznej w podstawie 10 dla obu osi. Dla log(N) < 1, występuje niewielka lub żadna tendencyjność wzrostu komórek, mierzona przez I b . Przy większych wartościach N, obserwowana tendencyjność zależy od wartości D, z maksimum występującym w pobliżu (D,N) = (1, 105). Ta wartość D odpowiada dyfuzyjności komórek i składników odżywczych równej wielkości i wokół tej wartości możliwe jest zaobserwowanie tendencyjności wzrostu dla wartości N tak małych jak 101,5. W typowych warunkach eksperymentalnych, N ma rząd wielkości 2, co wskazuje, że efekty DLG są najbardziej prawdopodobne do zaobserwowania, gdy D jest bliskie jedności.

Zakres zachowań jest dalej zilustrowany przez rozważenie rozkładów z dwóch kontrastujących przykładów. W każdym przypadku, rozwiązanie jest pokazane w czasie odpowiadającym maksymalnemu wychyleniu komórki. Dla D = 10-6 i N = 1, pokazanych na Rys. 4, stężenie pożywki stało się jednolite, zanim gęstość komórek zdążyła się wyraźnie przesunąć w prawą stronę, gdzie pożywka była początkowo skoncentrowana. W przeciwieństwie do tego, biorąc D = 10-0.5 i N = 105, również wykreślone na Rys. 4, komórki wykazują oczywistą preferencję w kierunku prawej strony domeny.

Analiza modelu continuum sugeruje, że jeśli \), to ukierunkowany wzrost, a tym samym wszelkie efekty DLG, wystąpią tylko przy wartościach N co najmniej tak dużych jak 103. Ponieważ szacunki wskazują, że N ma rząd wielkości 2, sugeruje to, że DLG będzie obserwowane tylko wtedy, gdy D jest bliskie jedności, jak widać na Rys. 4. Można to również zilustrować za pomocą parametrów fizycznych. Używając wartości parametrów podanych w rozdziale 3, mikrobom o dyfuzyjności \({D}_{m}=3 razy {10}^{-2}})mm2 min-1 umieszczonym w środowisku o maksymalnym początkowym stężeniu składników odżywczych \({N}_{0}mathrm{=3,8} razy {10}^{-3}})g mm-2 odpowiadałyby w przybliżeniu bezwymiarowe wartości D = 0,75 i N = 104. Na podstawie Rys. 4 można się spodziewać, że ten gatunek będzie rósł w kierunku źródła składników odżywczych, a więc wykazywał zachowanie DLG. Jeśli te same mikroorganizmy zostałyby umieszczone w środowisku o maksymalnym stężeniu substancji odżywczych \({N}_{0}) g mm-2, wartość N spadłaby do 10, a tendencyjny wzrost nie byłby już obserwowany. Wyniki tej sekcji dostarczają zatem ram dla identyfikacji, kiedy DLG ma wystąpić, bazując jedynie na szacunkach D i N.

Porównania doświadczalne

Po zbadaniu przewidywań modelu, wykorzystujemy je teraz do identyfikacji dominującego mechanizmu wzrostu w koloniach mikroorganizmów. Rozważymy trzy reprezentatywne przykłady doświadczalne pokazane na Rys. 1: dwie kolonie bakterii B. subtilis i jedną kolonię S. cerevisiae. Ponieważ nie znamy odpowiedniej wartości współczynnika dyfuzji D, który jest wymagany przez model reakcja-dyfuzja, wzrost jest zamiast tego charakteryzowany przez względny rozrzut Δ (2). Parametr ten reprezentuje stosunek średniego tempa zmian powierzchni kolonii, patrząc z góry, do dyfuzyjności glukozy i może być mierzony na podstawie obrazów. Ponieważ substancja odżywcza jest równomiernie rozprowadzana i hodowana jest tylko pojedyncza kolonia, oczekuje się, że wszelkie DLG w tych przykładach przejawia się jako nieregularny wzrost z ekranowaniem rozgałęzień (zjawisko I).

Obliczone wartości szybkości wzrostu Δ m są podane w tabeli 1, wraz z odpowiadającymi im względnymi szybkościami Δ. Wartości te wskazują, że kolonie B. subtilis rosną dwa rzędy wielkości szybciej niż kolonia drożdży i jeden rząd wielkości wolniej niż dyfuzyjność glukozy. Użycie typowych wartości dla początkowego stężenia substancji odżywczych sugeruje, że eksperymenty odpowiadają wartości N, która ma rząd wielkości 2. Dopasowanie tego oszacowania i wartości Δ do wyników modelu z Rys. 4 wskazuje, że B. subtilis odpowiada reżimowi, w którym wystąpi ukierunkowany wzrost spowodowany DLG. Ponieważ oszacowanie to zostało wykonane poprzez pomiar tempa proliferacji komórek p w kolonii S. cerevisiae, które prawdopodobnie będzie mniejsze niż odpowiadająca mu wartość dla bakterii, oczekuje się, że będzie to niedoszacowanie dla N, a większa wartość N zwiększa prawdopodobieństwo zaobserwowania DLG. W przeciwieństwie do tego, kolonia S. cerevisiae ma Δ rzędu wielkości -3, co wskazuje, że składnik odżywczy dyfunduje w znacznie szybszej skali czasowej niż skala wzrostu komórek. W konsekwencji oczekuje się, że wszelkie lokalne zmiany w stężeniu substancji odżywczej ulegną rozproszeniu zanim będą miały wpływ na morfologię kolonii. Wskazuje to, że DLG nie ma wpływu na morfologię. Tak więc, pomimo silnego podobieństwa pomiędzy kształtami kolonii bakteryjnych i drożdżowych w środowiskach o niskim stężeniu składników odżywczych, te dwie morfologie są wynikiem różnych zjawisk. Kolonie bakteryjne rosną na tyle szybko, że dyfuzja składników odżywczych może ograniczać ich wzrost, co skutkuje nieregularnym wzorem. Znacznie wolniejszy wzrost kolonii drożdży oznacza, że DLG nie może wystąpić, a zamiast tego, niejednolite morfologie kolonii powstające w środowiskach o niskiej zawartości składników odżywczych muszą być spowodowane wyłącznie wzrostem pseudohyphal.

Szukaliśmy dalszego potwierdzenia tych wyników, testując ukierunkowany wzrost (zjawisko III) w koloniach S. cerevisiae, naśladując układ stosowany przez Matsushitę & Fujikawę12 i w symulacjach40. Płytka Petriego była wypełniona syntetyczną dekstrozą niskoamonową (SLAD) z pożywką umieszczoną w środku płytki Petriego. Komórki drożdży były wysiewane w różnych odległościach od środka i fotografowane po 16 dniach wzrostu. Dalsze szczegóły eksperymentalne podano w rozdziale 3. Zarówno glukoza jak i siarczan amonu były używane jako ograniczone składniki odżywcze, a reprezentatywne obrazy dla każdego z nich pokazano na Rys. 5. Obrazy są zorientowane tak, że środek płytki Petriego, na której umieszczono pożywkę, znajduje się po prawej stronie. Dyfuzyjność amonu w wodzie wynosi około 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Ponieważ jest to ten sam rząd wielkości co dyfuzyjność glukozy, można się spodziewać, że każde źródło pożywki będzie miało podobną wartość Δ. Żadna z kolonii nie wykazuje zauważalnej tendencyjności wzrostu w jakimkolwiek kierunku i obie wytwarzają wskaźniki tendencyjności I b prawie dokładnie równe 0,5. Efektywne dyfuzyjności Δ m i bezwymiarowe dyfuzyjności Δ dla każdej próby są podane w tabeli 2. W obu przypadkach Δ ma rząd wielkości -3, co wskazuje, że ukierunkowany wzrost nie powinien być obserwowany i zgadza się z wynikami z poprzednich eksperymentów.

Obrazy z eksperymentów ukierunkowanego wzrostu z użyciem S. cerevisiae. Obrazy są zorientowane tak, że odpowiedni składnik odżywczy znajduje się po prawej stronie kolonii, jak wskazuje pionowy tekst. Kolonie były hodowane na (a) SLAD-G z glukozą dodaną po prawej stronie i (b) SLAD-N z siarczanem amonu dodanym po prawej stronie. Paski skali przedstawiają 5 mm.

Dalszych dowodów na tryb wzrostu dostarcza zachowanie w pobliżu krawędzi kolonii. Istnieją wyraźne oznaki nierównomiernego wzrostu wokół granicy kolonii hodowanej na SLAD-N, ale nie na kolonii hodowanej na SLAD-G. Gdyby ten wzór był spowodowany DLG, oczekiwalibyśmy podobnego zachowania na obu podłożach. Wiadomo jednak, że drożdże diploidalne, takie jak szczep AWRI796 użyty w tym eksperymencie, przechodzą do wzrostu pseudohyficznego, gdy są pozbawione azotu2, jak SLAD-N. To sugeruje, że niejednolity wzrost obserwowany w koloniach drożdży, takich jak pokazane na Rys. 1, jest spowodowany wzrostem pseudohyphal, a nie DLG.

.