Powstanie systemów transformacji genetycznej umożliwiło naukowcom transformację obcego DNA do grzybów strzępkowych i uzyskanie w ten sposób pożądanych szczepów do celów przemysłowych. Obecnie możemy w pełni wykorzystać doskonałe zdolności wydzielnicze grzybów i ich doskonałą wydajność w produkcji cennych metabolitów.

Protoplast-mediated transformation (PMT)

PMT jest najczęściej stosowaną metodą transformacji grzybów, która opiera się na dużej liczbie kompetentnych protoplastów grzybowych. Zasada polega na wykorzystaniu niektórych dostępnych w handlu enzymów do usuwania złożonych składników ściany komórkowej grzyba w celu wytworzenia protoplastów. Następnie, niektóre odczynniki chemiczne (takie jak PEG) są stosowane do promowania fuzji egzogennych kwasów nukleinowych i protoplastów, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej. Składniki ściany komórkowej grzyba są bardzo zróżnicowane pomiędzy różnymi szczepami. Nawet składniki płaszcza zarodników różnią się znacznie od składników płaszcza hyfusów tego samego szczepu. Dlatego nie ma uniwersalnej metody transformacji, którą można by zastosować do różnych szczepów grzybów. Przygotowanie protoplastów jest trudne do standaryzacji. Część trudności wynika z naszej ograniczonej wiedzy na temat hydrolaz ściany komórkowej. Opracowanie zoptymalizowanej metody PMT dla grzybów nadal wymaga znacznego wysiłku.

PMT jest rutynowo stosowaną metodą transformacji. Metoda ta jest stale udoskonalana w celu uzyskania wyższej wydajności transformacji genetycznej oraz w celu ukierunkowania odpowiednich loci genowych poprzez edycję genów. Przygotowanie protoplastów wymaga usunięcia ściany komórkowej, co uzyskuje się głównie poprzez obróbkę enzymatyczną. Opisano również nieenzymatyczne metody przygotowywania protoplastów, takie jak metody fizyczne, w tym mielenie i uderzenia falą naddźwiękową . Nie są one jednak szeroko stosowane ze względu na niedogodności praktyczne i niską wydajność protoplastów. Podsumowanie protokołów transformacji z udziałem protoplastów dla różnych gatunków grzybów przedstawiono w tabeli 1.

Podstawowe kroki metody PMT

PMT po raz pierwszy zastosowano do Saccharomyces cerevisiae. Naukowcy przygotowali protoplasty z komercyjną ślimakazą, a do konserwacji protoplastów użyli sorbitolu. Później taką metodę zastosowano do grzybów filamentowych, takich jak Neurospora crassa i A. nidulans. Chociaż metody transformacji zostały udoskonalone, podstawowe etapy pozostają zasadniczo takie same. Podstawowe etapy metody PMT przedstawiono na Rys. 1.

Podstawowe etapy transformacji wspomaganej protoplastami

Przygotowanie protoplastów

Pierwszym etapem przygotowania protoplastów jest usunięcie ściany komórkowej poprzez trawienie enzymatyczne. Ściana komórkowa grzybów składa się z glukanu, mannanu i chityny. Struktura ściany komórkowej grzybów jest bardzo dynamiczna, a ściana komórkowa zmienia się podczas podziałów komórkowych i wzrostu grzybów, jak również podczas kiełkowania zarodników, rozgałęziania się hyfusów i tworzenia przepony. Składniki ściany komórkowej są również różne u różnych gatunków grzybów, dlatego też różne enzymy powinny być stosowane w połączeniu. Podano, że wybór odpowiedniej mieszaniny enzymów jest kluczowym czynnikiem w preparatyce protoplastów .

Ogólnie rzecz biorąc, hyfusy są wrażliwe na odpowiedni enzym, który hydrolizuje ich ścianę komórkową w fazie logarytmicznej. W procedurze PMT Neurospora, protoplasty są przygotowywane przez hydrolizę nowo narodzonych hyfusów (hodowla przez 4-6 h w temperaturze 25-30 °C) . Podobnie, protoplasty mogą być również przygotowywane z konidiosporami. Na przykład, dla Aspergillus i Penicillium, można wybrać zarodniki germinalne lub talie .

Protoplasty są wrażliwe na ciśnienie osmotyczne, należy zadbać o utrzymanie stabilnego ciśnienia osmotycznego, aby utrzymać protoplasty w stanie nienaruszonym podczas enzymolizy ścian komórkowych. Dlatego stabilizatory osmotyczne (takie jak sorbitol, chlorek sodu i chlorek potasu) powinny być zawarte we wszystkich buforach do przygotowania protoplastów, aby uniknąć pęknięcia komórek. Na przykład, roztwór sorbitolu o stężeniu 0,8-1,2 M jest stosowany w preparatyce protoplastów N. crassa, Aspergillus sp. i Trichoderma sp. w celu utrzymania stabilności osmotycznej protoplastów. Podsumowanie parametrów przygotowania protoplastów dla niektórych popularnych gatunków grzybów przedstawiono w Tabeli 2.

Pobór egzogennego DNA

Roztwór używany do zawieszania protoplastów zwykle zawiera jony wapnia i stabilizatory osmotyczne. Uważa się, że wapń otwiera kanały w cytomembranie, co ułatwia wnikanie egzogennego DNA do komórki, podczas gdy stabilizatory osmotyczne są niezbędne do utrzymania morfologii protoplastów. Zazwyczaj do oczyszczonego DNA (może to być zarówno kolisty dwuniciowy DNA, jak i DNA zlinearyzowany) dodaje się pewną ilość glikolu polietylenowego (PEG). PEG jest powszechnie stosowanym promotorem fuzji komórkowej. Może on tworzyć mostek molekularny między komórkami lub między cytomembraną a DNA, a tym samym sprzyjać adhezji. Ponadto, może również wywoływać nieuporządkowane ładunki na powierzchni cytomembrany, zmieniać przepuszczalność błony i ułatwiać wnikanie egzogennych kwasów nukleinowych do komórek .

PEG jest kluczowym czynnikiem zwiększającym wydajność transformacji. Niska wydajność transformacji w większości przypadków może być poprawiona przez dodanie większej ilości PEG. W normalnych warunkach, wydajność PEG o niskiej masie cząsteczkowej (jak PEG3000) jest lepsza niż PEG o wysokiej masie cząsteczkowej (jak PEG8000). Jednakże, to musi być zoptymalizowane dla różnych gatunków .

Wydajność transformacji jest również pod wpływem temperatury. Ogólnie, mieszanina DNA i protoplastów powinna być umieszczona w lodzie na 15-30 min, tak aby DNA mogło przylgnąć do powierzchni protoplastów .

Regeneracja protoplastów

W celu zagwarantowania dobrego odzysku żywotnych protoplastów, protoplastom pozwala się na regenerację na płytce bez presji selekcyjnej przez pewien czas, zanim zostaną przeniesione na płytkę selekcyjną. Stabilizator osmotyczny powinien być włączony do kultury regeneracyjnej. Stabilne ciśnienie osmotyczne jest kluczowym czynnikiem dla protoplastów do regeneracji ściany komórkowej. Tylko protoplasty, które niosą egzogenne kwasy nukleinowe mogą rosnąć na podłożu selektywnym.

Komentarze dotyczące metody PMT

Metoda transformacji protoplastów jest prosta i skuteczna, nie wymaga drogiego sprzętu. Jednak protokół obejmuje wiele etapów i krytycznych odczynników. Każdy krok musi być zoptymalizowany, a jakość odczynników krytycznie sprawdzona. Status wzrostu przekształcanych grzybów musi być starannie monitorowany. Doświadczenie jest kluczowe dla pomyślnego wdrożenia tej metody.

Agrobacterium -mediated transformation (AMT)

Agrobacterium jest Gram-ujemną bakterią powszechnie występującą w glebie. Agrobacterium tumefaciens może infekować zranione rośliny. Plazmid wywołujący nowotwory o > 200 kb, który jest również określany jako plazmid Ti, może być wyizolowany we wczesnym stadium infekcji. Kiedy A. tumefaciens infekuje roślinę, wnika do niej przez ranę i integruje część plazmidu Ti do genomu zainfekowanych komórek roślinnych. Zintegrowany fragment DNA z plazmidu Ti jest powszechnie określany jako transfer DNA lub T-DNA. T-DNA wstawia się do genomu rośliny w sposób losowy jako monoklon. T-DNA jest flankowany przez dwa kierunkowe, niedoskonałe powtórzenia (zwane lewą i prawą granicą) i zawiera geny kodujące enzymy odpowiedzialne za powstawanie hormonów roślinnych, które powodują wzrost nowotworów. Zaprojektowano wektor binarny, w którym gen docelowy wstawiono pomiędzy lewą i prawą granicę T-DNA, a zrekombinowany plazmid transformowano do Agrobacterium tumefaciens. Pozytywny klon Agrobacterium został użyty jako nośnik do integracji docelowego genu do genomu grzyba. Poszczególne etapy zostaną szczegółowo omówione poniżej.

Metoda AMT okazała się bardziej stabilna i wydajna niż konwencjonalne metody transformacji od czasu pierwszej pracy, w której stwierdzono, że metoda ta może być stosowana do transformacji grzybów. Metoda AMT została po raz pierwszy zastosowana do transformacji S. cerevisiae. Plazmid niosący gen oporności na higromycynę jest powszechnie stosowany do transformacji Aspergillus awamori . Metoda AMT została zastosowana do wielu Ascomycetes, w tym Aspergillus i Monascus purpureus. Podstawowe etapy metody AMT przedstawione są na Rys. 2. Podsumowanie protokołu transformacji z udziałem Agrobacterium dla różnych gatunków grzybów przedstawiono w tabeli 3.

Podstawowe etapy transformacji z udziałem Agrobacterium

Factors that influence the AMT efficiency

Wiele czynników wpływa na wydajność AMT, w tym rodzaj wyjściowego materiału grzybowego (protoplast, zarodnik, hyfaza, tkanka owocnika), stężenie acetosyringonu, stosunek grzyba do Agrobacterium oraz warunki współkultury.

1. Rodzaj wyjściowego materiału grzybowego W metodzie AMT jako biorcę można wykorzystać protoplasty, zarodniki, hyfusy i tkankę ciała owocnika grzybów. Dla różnych szczepów należy wybrać odpowiednie materiały wyjściowe. Na przykład, metoda AMT działa tylko dla protoplastów Rhizopus. oryzae i Mucor circinelloides, podczas gdy zarodniki lub zarodniki nie wytworzyłyby transformantów .

2. Stężenie acetosyringonu (AS) AS działa na dwóch etapach podczas procesu AMT. Jednym z nich jest proces indukcji, a drugim proces transformacji. AS jest zwykle używany do indukowania ekspresji domeny Vir w T-DNA, a gen w domenie Vir aktywuje transfer T-DNA. Liczne badania wykazały, że odpowiednia ilość AS była konieczna podczas procesu transformacji. Jednakże, dodanie AS nie jest absolutnie konieczne na etapie wstępnej hodowli Agrobacterium, co może obniżyć wydajność transformacji dla niektórych szczepów. Stężenie AS jest ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność transformacji podczas procesu ko-kultury grzyb-Agrobacterium w AMT Aspergillus awamori .

3. Stosunek grzybów do Agrobacterium W pewnych granicach wydajność transformacji osiągnie maksymalny poziom wraz ze wzrostem ilości grzyba lub Agrobacterium. Optymalny stosunek dla AMT dla różnych grzybów musi być określony empirycznie. Stosunek komórek grzybowych do bakteryjnych powinien być zoptymalizowany dla różnych systemów transformacji grzyb-Agrobacterium.

4. Warunki współhodowli Warunki współhodowli są ważnym czynnikiem w metodzie AMT. Obejmują one czas hodowli, temperaturę, pH oraz wybór filtra. Temperatura i czas współkultury są kluczowymi czynnikami wśród etapów AMT. W transformacji grzyb-Agrobacterium, odpowiednimi warunkami do rozpoczęcia jest temperatura 20-28 °C i czas współhodowli 16-96 h. Niższa temperatura (20-25 °C) jest zazwyczaj korzystna dla metody AMT. Filtr, który jest hydrofilowy i służy jako podłoże do współhodowli grzybów i bakterii, ułatwia przenoszenie pojedynczych kolonii na płytkę przesiewową. Jako filtr można stosować membranę nitrocelulozową, nylonową, bibułę filtracyjną, celofan i membranę z fluorku poliwinylidenu (PVDF).

Komentarze dotyczące transformacji z udziałem Agrobacterium

Metoda AMT otwiera nową drogę dla tych grzybów, które nie poddają się transformacji metodami konwencjonalnymi. Metoda AMT jest szczególnie odpowiednia do generowania mutacji typu knock-in u grzybów, ponieważ T-DNA losowo wstawia się do genomu jako pojedyncza kopia. Ponadto, AMT może osiągnąć wysoką wydajność rekombinacji homologicznej w różnych eksperymentach ukierunkowania genów .

Główne zalety metody AMT obejmują: po pierwsze, zróżnicowanych odbiorców transformacji, w tym protoplasty, strzępki i zarodniki; po drugie, zdolność do integracji egzogennych genów z genomem w celu utworzenia stabilnych transformantów; i po trzecie, wysoką wydajność transformacji skutkującą dużą liczbą transformantów .

Metoda AMT wymaga wektorów binarnych, których przygotowanie jest żmudne. W optymalizacji procesu transformacji należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Jest to główne ograniczenie metody AMT .

Transformacja elektroporacyjna

Elektroporacja jest prostą, szybką i wydajną metodą transformacji grzybów strzępkowych. W elektroporacji, ładunki elektryczne są przechowywane w kondensatorze, aby zbudować wysokie napięcie, próbka jest uderzana przez napięcie impulsowe, a egzogenny kwas nukleinowy może być natychmiast przeniesiony do komórek. Zazwyczaj fale kwadratowe lub fale o wykładniczym rozkładzie są stosowane w transformacji grzybów . Impulsy o wykładniczym zaniku są generowane po prostu przez ładowanie i rozładowywanie kondensatora. Pole elektryczne maleje wykładniczo od wartości szczytowej. Fala kwadratowa jest niesinusoidalnym przebiegiem okresowym (który może być przedstawiony jako nieskończona suma fal sinusoidalnych), w którym amplituda zmienia się ze stałą częstotliwością pomiędzy ustalonymi wartościami minimalnymi i maksymalnymi. Dla różnych gatunków stosuje się różne przebiegi elektroporacji. Podsumowanie przebiegów stosowanych w elektroporacji dla różnych gatunków przedstawiono w tabeli 4.

Gdy komórka jest wystawiona na działanie pola elektrycznego, struktura cytomembrany zostanie zmieniona dzięki napięciu indukowanemu pomiędzy cytomembraną. Po szoku elektrycznym w cytomembranie mogą powstać mikropory. Wywołana przepuszczalność ściany komórkowej jest odwracalna w granicach progu napięcia i czasu trwania, w przeciwnym razie spowoduje nieodwracalne uszkodzenie komórek. Dlatego mikropory w cytomembranie wydają się mieć dwa wzorce po wstrząsie elektrycznym, odwracalny i nieodwracalny. Cząsteczki lipidów i białek w cytomembranie mogą przywrócić pierwotną strukturę, gdy zastosuje się odpowiednie natężenie pola, podczas gdy nieodwracalny szok elektryczny spowoduje nieodwracalność lub bardzo powolne odzyskiwanie, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki. Egzogenne DNA może być przenoszone do bakterii, protoplastów roślin, komórek zwierzęcych i grzybów strzępkowych poprzez elektroporację. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do wielu grzybów. Ozeki i wsp. odkryli, że zarodniki zarodkowe są bardziej podatne na transformację przez elektroporację. W ostatnich latach, elektroporacja stała się niezawodną metodą transformacji genowej niektórych powszechnie występujących szczepów. Podsumowanie protokołów transformacji z wykorzystaniem elektroporacji dla różnych gatunków grzybów przedstawiono w Tabeli 5.

Faktory wpływające na transformację z wykorzystaniem elektroporacji

Parametry elektroporacji

1. Natężenie pola elektrycznego Natężenie pola elektrycznego jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na wydajność elektroporacji. Gdy zastosowane natężenie pola elektrycznego osiągnie wielkość kV/cm i szerokość impulsu w skali μs-ms, cytomembrana zostanie zmieniona, a na ścianach komórkowych powstanie wiele mikroporów. Wysokie natężenie pola elektrycznego wiąże się z wysokim współczynnikiem absorpcji egzogennych kwasów nukleinowych i niższym współczynnikiem przeżywalności komórek. Jednak różne typy komórek wymagają różnych natężeń pola elektrycznego ze względu na różnice w składnikach cytomembrany. Niewiele mikroporów powstaje, gdy natężenie pola elektrycznego nie przekracza wymaganego progu. Przeciwnie, nadmierne natężenie pola elektrycznego spowoduje nieodwracalne uszkodzenie cytomembrany, prowadząc do śmierci komórki .

2. Pojemność Podczas procesu elektroporacji zmienność ładunków elektrycznych i natężenia pola elektrycznego przyłożonego do zawiesiny komórek zależy od pojemności i czasu trwania impulsu. Na intensywność i czas trwania impulsu wpływa również pojemność, dlatego większa pojemność ma lepsze efekty transformacji .

3. Czas trwania impulsu i częstotliwość Na czas trwania perforacji na cytomembranie, który jest bezpośrednio związany z wydajnością transformacji elektroporacji, wpływa czas trwania impulsu i częstotliwość .

Środowisko elektroporacji i czynniki zewnętrzne

1. Roztwór buforowy Roztwór buforowy zapewnia ważne środowisko dla elektroporacji komórek, a wartość pH roztworu buforowego szoku elektrycznego ma ogromne znaczenie. Zwykle stosuje się bufor o pH 7,0. Komórki są łatwo nakłuwane i zabijane przy pH wyższym niż 7,0 .

2. Temperatura Podczas procesu elektroporacji wytwarzana jest duża ilość ciepła, która zostanie uwolniona do roztworu buforowego. Dlatego dla lepszego efektu zalecana jest obniżona temperatura (0-4 °C). Ponadto, opalanie lodem mieszaniny przed szokiem elektrycznym może również poprawić wydajność szoku elektrycznego.

3. Stężenie egzogennego kwasu nukleinowego Ogólnie rzecz biorąc, wydajność elektroporacji wzrasta wraz ze stężeniem egzogennego kwasu nukleinowego. Compact superhelix DNA łatwiej wnika do komórek przez cytomembranę. W 1995 roku w jednym z badań podano, że każdy 1 μg plazmidowego DNA może wygenerować 100 transformantów dla A. niger .

Komentarze dotyczące metody elektroporacji

Metoda elektroporacji została szeroko zastosowana do wielu typów komórek, w tym prokariotów i eukariotów. Technologia ta ma potencjał, aby stać się metodą z wyboru dla transformacji niezbadanych gatunków grzybów. W porównaniu z metodą PMT, która wymaga skomplikowanych etapów, elektroporacja jest prosta i wygodniejsza. Jednak mechanizm działania elektroporacji nadal pozostaje niejasny. Szybkość perforacji cytomembrany jest zależna od wielu parametrów pola elektrycznego. A także, wymaga odpowiednich warunków buforowych, aby być optymalnie efektywną.

Transformacja biologiczna

Transformacja biologiczna znana jest również jako bombardowanie cząsteczkami. Jego zasada jest to, że obcy DNA jest adsorbowany na powierzchni cząstek wolframu lub złota. Pod naciskiem wysokiego ciśnienia, cząstki są wstrzykiwane do komórek gospodarza. Bombardowanie cząstek może realizować zarówno stabilne i przemijające transformation.

Różne czynniki wpływają na skuteczność bombardowania we wzorach złożonych interakcji . Parametry biologiczne (typ komórek, warunki wzrostu i gęstość komórek) oraz ustawienia instrumentalne (typ i rozmiar cząstek, poziom próżni i ciśnienia, odległość od celu) są ważnymi zmiennymi.

Bombardowanie cząsteczkowe jest najpotężniejszą spośród wszystkich metod transformacji genetycznej. Nie podlega ograniczeniom wynikającym z typów komórek gospodarza lub gatunków. W przypadku grzybów bombardowanie cząsteczkowe jest wystarczająco wydajne dla tych organizmów, które są trudne do hodowli lub z których trudno jest przygotować protoplasty. Bombardowanie cząsteczkowe jest łatwe i wygodne w obsłudze. Jednakże, instrumenty i materiały eksploatacyjne do bombardowania cząsteczkowego są drogie. Będzie ona brana pod uwagę tylko w przypadku, gdy inne metody zawiodą. Obecnie, bombardowanie cząsteczkowe zostało wykorzystane do skutecznego przekształcenia A. nidulans i T. reesei , itp.

Shock-wave-mediated transformation (SWMT)

SWMT wykorzystuje zasadę transformacji i transmisji energii do generowania przejściowych zaburzeń ciśnienia i siły skręcającej w poprzek komórek, aby utworzyć przejściowy efekt kawitacji . Metoda ta została zastosowana w leczeniu medycznym, takim jak ortopedia i kruszenie kamieni nerkowych. SWMT zmienia przepuszczalność błon komórkowych poprzez kawitację akustyczną, co powoduje wchłanianie egzogennych kwasów nukleinowych do komórek. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana we wprowadzaniu egzogennego kwasu nukleinowego do Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Salmonella typhimurium . W 2013 roku Denis Magaña-Ortíz i wsp. po raz pierwszy donieśli o zastosowaniu SWMT dla grzybów, w tym A. niger, Fusarium oxysporum i Phanerochaete chrysosporium . W artykule tym zwrócono uwagę na trzy zalety metody SWMT. Po pierwsze, w porównaniu z konwencjonalnymi metodami transformacji, metoda ta jest w stanie bezpośrednio oddziaływać na zarodniki, ale nie na protoplasty. Po drugie, parametry fizyczne były łatwe do kontrolowania, jedynie liczba zarodników, energia i prędkość fali uderzeniowej musiały być precyzyjnie kontrolowane. Po trzecie, wydajność transformacji była doskonała. Wyniki Denisa Magaña-Ortíz i wsp. wskazują, że w porównaniu z metodą transformacji Agrobacterium, metoda SWMT może zwiększyć wydajność transformacji o 5400 razy dla A. niger .

Ale pewne ograniczenia w tej metodzie transformacji były również godne uwagi. Ponieważ duża część DNA ulega uszkodzeniu podczas obróbki falą uderzeniową, wydajność transformacji określona stosunkiem DNA do komórek była dość niska. Jednak w przypadku liczby zaangażowanych komórek wydajność transformacji była znacznie wyższa. Oceniając wydajność, należy wziąć pod uwagę dwa aspekty: ilość DNA i liczbę komórek. Na przykład, w eksperymencie przeprowadzonym przez Magana-Ortiz i wsp. , generalnie, plazmidowe DNA używane do transformacji protoplastów i elektroporacji wynosi około 1-10 μg. Wyprodukowanie tak dużej ilości plazmidu w laboratorium dla metody SWMT jest drogie i niewygodne. Ponadto, źródła fali uderzeniowej i aparaty są drogie, ponieważ są przeznaczone głównie do celów medycznych. To okazuje się być główną przeszkodą w przyjęciu tej metody w laboratorium mikrobiologicznym z ograniczonymi zasobami.

.