Results and Discussion

Nasza nowatorska metoda AMHS jest ułatwiona dzięki anatomiczno-funkcjonalnej budowie układu krwionośnego pszczół. Krążenie wymuszane jest przez pulsacyjne skurcze przepony grzbietowej i brzusznej, które pompują hemolimfę do serca. Następnie aorta transportuje hemolimfę do głowy (Ryc. 1F) , dostarczając ją do mózgu i czułków pszczoły.

W porównaniu z TCHS, AMHS umożliwiał pobranie 80-100 μL sterylnej hemolimfy w krótszym czasie i od mniejszej liczby osobników, co minimalizowało ryzyko melanizacji. Uważamy, że podczas pobierania hemolimfy ważne jest, aby zminimalizować czas jej kontaktu z powietrzem. Ryzyko melanizacji jest mniejsze przy krótszym czasie pobierania i szybszym przejściu do etapu chłodzenia. Oprócz skróconego czasu pobierania hemolimfy, kolejną istotną przewagą AMHS nad TCHS jest ograniczenie wykorzystania owadów. Badania nad pszczołami powinny być zawsze zaprojektowane w taki sposób, aby zminimalizować liczbę pszczół, które muszą zostać uszkodzone. Zastosowanie AMHS w celu zmniejszenia liczby pszczół potrzebnych do zebrania wymaganej objętości hemolimfy jest zgodne z zasadami przewodnimi dla bardziej etycznego wykorzystania zwierząt w badaniach naukowych. Nasze obecne wyniki wykazały również, że większy rozmiar owada był związany z łatwiejszym i szybszym pobieraniem próbek hemolimfy oraz z większą objętością zebranej hemolimfy (Tabela 1). Pobieranie próbek hemolimfy od robotnic Apis mellifera carnica i Apis cerana trwało dłużej i wymagało większej liczby owadów niż pobieranie próbek hemolimfy od trzmieli, ponieważ te pierwsze gatunki są znacznie mniejsze i mają mniej hemolimfy.

Hemolimfę najczęściej pozyskuje się za pomocą naczyń włosowatych, stosując różne metody, na przykład nakłuwając serce, grzbietową lub brzuszną zatokę klatki piersiowej lub grzbietową aortę. Każda z tych procedur niesie ze sobą ryzyko nakłucia komory serca, co prowadzi do zanieczyszczenia próbki treścią jelitową. Takie zanieczyszczenie nie tylko sprawia, że próbka nie nadaje się do użytku, ale również wymaga wymiany kapilary na nową lub oczyszczenia i dezynfekcji przed kolejnym użyciem – co wydłuża całkowity czas pobierania hemolimfy. Sterylność hemolimfy może być również naruszona przez nakłucie membrany łączącej segmenty brzucha. Użycie AMHS eliminuje te problemy związane z kapilarami. Co więcej, pobieranie hemolimfy przez dekapitację może zanieczyścić hemolimfę nektarem wyciekającym z żołądka pszczoły. Nasz nowy AMHS pozwolił na uzyskanie próbek hemolimfy o wysokiej jakości biologicznej. Hemocyty były wyraźnie widoczne w każdej próbce hemolimfy uzyskanej za pomocą AMHS (Rys. 1C). Analiza każdego szkiełka mikroskopowego wykazała, że próbki hemolimfy uzyskane za pomocą AMHS były czyste i przejrzyste, bez żadnych zanieczyszczeń (np. ziaren pyłku).

Spodziewaliśmy się, że podczas wykonywania AMHS, dezynfekcja etanolem i ograniczony kontakt między kroplą hemolimfy a ciałem pszczoły zapewni sterylność próbki. Oczekiwanie to zostało potwierdzone badaniami mikrobiologicznymi. Inkubacja hemolimfy pozyskanej przez AMHS na podłożach MRS i Sabouraud agar potwierdziła sterylność hemolimfy. Na żadnej z posiewanych 100 kropli hemolimfy nie zaobserwowano wzrostu mikroorganizmów. Dlatego nie przedstawiono tu wyników ilościowych. Po zakończeniu okresu inkubacji, obserwowaliśmy jedynie ciemnobrązowe kręgi zmelanizowanej hemolimfy wokół każdej kropli. Melanizacja ta wystąpiła podczas okresu inkubacji, a nie podczas pobierania próbek (Rys. 1D i 1E). Warto zauważyć, że gdy pobrana hemolimfa nie ma być użyta do badań mikrobiologicznych, etap dezynfekcji może być pominięty. Jest możliwe, że etanol zastosowany w okolicy antenalnej może wpływać na aktywność enzymów lub hormonów.

Czynniki inne niż metodyka mogą wpływać na efektywność pobierania hemolimfy. W naszych poprzednich badaniach zaobserwowaliśmy, że ilość hemolimfy pobranej od pszczoły zależy nie tylko od jej kasty i wieku, ale także od stopnia jej uwodnienia mierzonego na podstawie objętości nektaru lub syropu cukrowego spożytego przed pobraniem próbki hemolimfy. Ptaszyńska i wsp. podają, że pobieranie próbek właściwej objętości hemolimfy jest mniej efektywne od pszczół starszych. Ponadto, efektywność pobierania próbek może zależeć od umiejętności laboratoryjnych badacza. Czynniki te utrudniają porównanie cech ilościowych różnych protokołów pobierania próbek hemolimfy w badaniach prowadzonych w różnych laboratoriach i z użyciem różnych organizmów. W naszych poprzednich badaniach pobraliśmy próbki hemolimfy od tysięcy pszczół stosując AMHS, jak również inne metody, w tym TCHS . Personel naszego laboratorium ma duże doświadczenie w pobieraniu hemolimfy od pszczół w różnym wieku i z różnych kast. Doświadczenie to pomogło nam porównać różne metody pobierania próbek, ponieważ na nasze wyniki nie miały wpływu błędy wynikające ze zmiennych umiejętności personelu laboratorium. Nasze obecne wyniki wskazały, że AMHS był skuteczną, czystą i wysoce dokładną metodą (Tabela 1), która była mniej czasochłonna niż TCHS .

Pobieranie hemolimfy przy użyciu metod innych niż AMHS zazwyczaj wymaga dodatkowego sprzętu, takiego jak rurki mikrokapilarne. Ponadto, usunięcie hemolimfy z rurek mikrokapilarnych wymaga albo użycia specjalnej pompy, albo zgniecenia rurek i odwirowania ich za pomocą kulek. Kolejną zaletą AMHS jest możliwość użycia skali pipetowej do pomiaru objętości hemolimfy pobranej od pojedynczej pszczoły. Jest to szczególnie przydatne podczas wykonywania analiz biochemicznych mikropróbek, np. w celu określenia aktywności enzymów. Warto zauważyć, że przy stosowaniu metod innych niż AMHS , objętość czystej hemolimfy może być obliczana pośrednio, na podstawie objętości rozcieńczalnika hemolimfy w probówce przed pobraniem próbki i zmierzonej objętości rozcieńczalnika hemolimfy po pobraniu próbki. Jednak taka metoda może prowadzić do dodatkowego błędu; dlatego niektórzy badacze używają strzykawek Hamiltona . AMHS pozwala uniknąć kosztów i dodatkowej pracy (np. zatykania strzykawek, dezynfekcji itp.) związanych z użyciem strzykawek Hamiltona.

Metoda Mayacka i Nauga (hemolimfę pozyskuje się przez wirowanie pszczół z obciętymi czułkami) jest podobna do AMHS. Jednakże ich metoda wymaga zarówno wirówki laboratoryjnej, a części gębowe pszczół musiały być zaklejone, aby zapobiec ewentualnemu zanieczyszczeniu. Co więcej, w ich badaniu, przed odwirowaniem pszczół, przeprowadzono sekcję wnętrzności pszczół w celu oceny infekcji Nosema ceranae. Bez tego kroku wnętrzności byłyby prawdopodobnym źródłem skażenia. Ich metoda polegała na umieszczeniu pszczół w probówkach wirówki i odwirowaniu ich przy 16 000 RCF przez 30 sekund w celu uzyskania hemolimfy. Proces ten może powodować rozwarstwienie składników hemolimfy (np. białek i hemocytów) i niesie ze sobą zwiększone ryzyko skażenia mikrobiologicznego i melanizacji hemolimfy (patrz dyskusja powyżej). Chociaż może być idealna do analizy poziomu cukru w hemolimfie u pszczół zbieraczek z uprzednio usuniętymi wnętrznościami (jak w ich badaniu), nie jest całkowicie odpowiednia do badań mikrobiologicznych i genetycznych lub badań aktywności enzymów. W tym kontekście, nasza nowa metoda AMHS jest bardziej odpowiednia do ogólnego zastosowania, jest łatwa i prosta, i prawdopodobnie znajdzie zastosowanie w wielu różnych typach badań.