Eredmények és vita
Az új AMHS-módszerünket megkönnyíti a méhek keringési rendszerének anatómiai/funkcionális felépítése. A keringést a dorzális és ventrális rekeszizom pulzáló összehúzódása kényszeríti ki, amely a hemolimfát a szívbe pumpálja. Ezután az aorta szállítja a hemolimfát a fejbe (1F ábra), amely a méh agyát és antennáit látja el hemolimfával.
A TCHS-hez képest az AMHS lehetővé tette 80-100 μL steril hemolimfa gyűjtését rövidebb idő alatt és kisebb számú egyedtől, ami minimalizálta a melanizáció kockázatát. Úgy véljük, hogy a hemolimma gyűjtése során fontos, hogy minimalizáljuk a levegővel való érintkezésének idejét. A melanizációs kockázatot csökkenti a rövidebb gyűjtési idő és a hűtési lépéshez való gyorsabb továbbhaladás. A rövidebb gyűjtési idő mellett a rovarok csökkentett használata az AMHS másik jelentős előnye a TCHS-sel szemben. A méhfélékkel kapcsolatos kutatásokat mindig úgy kell megtervezni, hogy a lehető legkevesebb méhet kelljen károsítani. Az AMHS alkalmazása a szükséges hemolimma-mennyiség begyűjtéséhez szükséges méhek számának csökkentésére összhangban van az állatok etikusabb kutatási célú felhasználásának irányadó elveivel.
Jelenlegi eredményeink azt is kimutatták, hogy a nagyobb rovarméret könnyebb és gyorsabb hemolimma-mintavétellel, valamint a begyűjtött hemolimma nagyobb mennyiségével járt együtt (1. táblázat). Az Apis mellifera carnica és Apis cerana dolgozókból történő hemolimfaminta-vétel tovább tartott és több rovarra volt szükség, mint a poszméhektől történő hemolimfaminta-vétel, mivel az előbbi fajok lényegesen kisebbek és kevesebb hemolimfával rendelkeznek.
A hemolimfát leggyakrabban kapillárisokkal nyerik különböző módszerekkel, például a szív, a dorzális vagy ventrális mellkasi sinus vagy a dorzális aorta átszúrásával . Ezen eljárások mindegyike magában hordozza annak kockázatát, hogy a kamra átszúródik, ami a minta béltartalommal való szennyeződéséhez vezet. Az ilyen szennyeződés nemcsak a mintát teszi használhatatlanná, hanem azt is megköveteli, hogy a kapillárt újjal cseréljék ki, vagy tisztítsák és fertőtlenítsék a következő használat előtt – így növelve a teljes hemolimfagyűjtési időt. A hemolimpha sterilitását a hasi szegmenseket összekötő membrán átszúrása is veszélyeztetheti. Az AMHS használata kiküszöböli ezeket a kapillárisokkal kapcsolatos problémákat. Ezenkívül a lefejezéssel történő hemolimfagyűjtés a méh gyomrából szivárgó nektárral szennyezheti a hemolimfát. Újszerű AMHS-ünk magas biológiai minőségű hemolimfamintákat eredményezett. A hemociták jól láthatóak voltak minden egyes AMHS-sel nyert hemolimfamintában (1C. ábra). Az egyes mikroszkópos tárgylemezek elemzése azt mutatta, hogy az AMHS-sel nyert hemolimfaminták tiszták és átlátszóak voltak, szennyeződések (pl. virágporszemek) nélkül.
Az AMHS végrehajtása során arra számítottunk, hogy az etanolos fertőtlenítés és a hemolimfacsepp és a méhtest közötti korlátozott érintkezés biztosítja a minták sterilitását. Ezt a várakozást a mikrobiológiai vizsgálatok megerősítették. Az AMHS által nyert hemolimma MRS és Sabouraud agar táptalajon történő inkubálása egyaránt megerősítette a hemolimfa sterilitását. A 100 hemolimmacseppből készült lemezeken nem figyeltek meg mikroorganizmusok növekedését. Ezért itt nem mutatunk be kvantitatív eredményeket. Az inkubációs időszak befejezése után minden csepp körül csak sötétbarna, melanizált hemolimfa köröket figyeltünk meg. Ez a melanizáció az inkubációs időszak alatt következett be, nem pedig a mintavétel során (1D. és 1E. ábra). Figyelemre méltó, hogy ha a begyűjtött hemolimfát nem kívánjuk mikrobiológiai vizsgálatra felhasználni, a fertőtlenítési lépés elhagyható. Lehetséges, hogy az antennák területén alkalmazott etanol befolyásolhatja az enzimek vagy hormonok aktivitását.
A módszertanon kívül más tényezők is befolyásolhatják a hemolimfagyűjtés hatékonyságát. Korábbi vizsgálatainkban megfigyeltük, hogy a méhből begyűjtött hemolimma mennyisége nemcsak a méh kasztjától és korától függ, hanem a méh hidratáltsági fokától is, amelyet a hemolimma-mintavétel előtt elfogyasztott nektár vagy cukorszirup mennyisége alapján mértünk. Ptaszyńska és munkatársai arról számolnak be, hogy a megfelelő mennyiségű hemolimfából történő mintavétel kevésbé hatékony az idősebb méhektől. Ezenkívül a mintavétel hatékonysága függhet a kutató laboratóriumi ismereteitől. Ezek a tényezők megnehezítik a különböző hemolimfaminta-mintavételi protokollok mennyiségi jellemzőinek összehasonlítását a különböző laboratóriumokban és különböző szervezetek felhasználásával végzett vizsgálatok között. Korábbi vizsgálataink során több ezer méhből vettünk hemolimfamintát az AMHS, valamint más módszerek, köztük a TCHS segítségével. Laboratóriumunk személyzete jelentős tapasztalattal rendelkezik a különböző korú és kasztú méhektől származó hemolimma gyűjtésében. Ez a tapasztalat segített a különböző mintavételi módszerek összehasonlításában, mivel eredményeinket nem befolyásolták a laboratóriumi személyzet változó képességeiből adódó hibák. Jelenlegi eredményeink azt mutatták, hogy az AMHS hatékony, tiszta és nagy pontosságú módszer (1. táblázat), amely kevésbé időigényes, mint a TCHS .
Az AMHS-től eltérő módszerekkel történő hemolimfaminta-vétel általában további felszerelést igényel, például mikrokapilláris csöveket. Ezenkívül a hemolimma eltávolítása a mikrokapilláris csövekből vagy egy speciális pumpa használatát, vagy a csövek összenyomását és gyöngyökkel történő centrifugálását igényli. Az AMHS másik előnye, hogy egy pipettás mérleg segítségével meg lehet mérni az egyes méhekből gyűjtött hemolimma mennyiségét. Ez különösen hasznos a mikrominták biokémiai elemzésénél, pl. az enzimaktivitás meghatározásánál . Érdemes megjegyezni, hogy az AMHS-től eltérő módszerek alkalmazásakor a tiszta hemolimfa térfogata közvetve is kiszámítható, a mintavétel előtt a csőben lévő hemolimfahígító térfogata és a mintavétel után mért hemolimfahígító térfogata alapján. Ez a módszer azonban további hibához vezethet, ezért egyes kutatók Hamilton fecskendőket használnak. Az AMHS elkerüli a Hamilton fecskendők használatával járó költségeket és többletmunkát (pl. a fecskendő dugulásmentesítés, fertőtlenítés stb.).
Mayack és Naug módszere (a hemolimfát a méhek csípős csápokkal történő pörgetésével nyerik) hasonló az AMHS-hez. Az ő módszerükhöz azonban egyrészt laboratóriumi centrifuga szükséges, másrészt a méhek szájrészeit le kellett ragasztani, hogy megakadályozzák az esetleges szennyeződést. Ezenkívül vizsgálatukban a méhek pörgetése előtt felboncolták a méhek beleit a Nosema ceranae-fertőzöttség felmérése érdekében. E lépés nélkül a belek a fertőzés valószínű forrását jelentenék. Módszerükhöz a méheket centrifugacsövekbe helyezték, és 16 000 RCF-en 30 másodpercig pörgették őket a hemolimma kinyerése érdekében. Ez az eljárás rétegezheti a hemolimfa összetevőit (pl. a fehérjéket és a hemocitákat), és fokozott kockázatot jelent a mikrobiológiai szennyeződés és a hemolimfa melanizációja szempontjából (lásd a fenti tárgyalást). Bár ideális lehet a hemolimfacukorszintek elemzésére a korábban eltávolított bélzettel rendelkező méhpempők körében (mint az ő vizsgálatukban), nem teljesen megfelelő mikrobiológiai és genetikai vizsgálatokra vagy az enzimaktivitások vizsgálatára. Ebben az összefüggésben a mi új AMHS-módszerünk alkalmasabb általános használatra, mivel könnyű és egyszerű, és valószínűleg számos különböző típusú vizsgálatban alkalmazható.