Diskret modell

Växlingen av en mikrobisk koloni som konsumerar ett diffuserande näringsämne representeras med hjälp av en nätbaserad modell som introducerades av Matsuura23, som beskrivs närmare i avsnitt 3. Kortfattat betraktar vi ett rektangulärt gitter med L x- och L y-platser i x- respektive y-riktningen. Antalet ockuperade celler betecknas ν med motsvarande celltäthet ρ = ν/(L x L y ). Varje element i det rektangulära gitteret får rymma högst en cell men kan innehålla ett icke-negativt heltal av näringspartiklar, oavsett om det också finns en cell på den platsen. Vid varje tidssteg kan jästcellerna absorbera en näringspartikel som befinner sig på samma plats och producera en enda dottercell på en intilliggande plats i en kardinalriktning, medan näringspartiklarna kan ta s steg, återigen i kardinalriktningarna. Som utgångsläge sås cellerna i gittret i ett föreskrivet mönster, medan ett antal näringspartiklar placeras jämnt slumpmässigt inom området för att ge en specificerad genomsnittlig utgångskoncentration c0. Domänens gränser behandlas som fasta väggar, vilket replikerar det experimentella beteendet i en petriskål. Viktigt är att de mönster som produceras av denna modell enbart är resultatet av interaktionen mellan cellerna och näringsämnet, så att alla oenhetliga morfologier som produceras av modellen helt och hållet kan tillskrivas DLG.

Karakteristiska DLG-morfologier

Matsushita & Fujikawa12 använde en koloni av B. subtilis-celler för att illustrera tre nyckelfenomen som uppstår på grund av DLG: (I) ”screening” av kortare grenar genom längre grenar, (II) avstötning mellan angränsande kolonier och (III) tillväxt riktad mot en näringskälla (fig. 2). Det har tidigare visats att dessa egenskaper uppstår enbart på grund av DLG med hjälp av en gitterbaserad modell för koloniväxter som liknar den som används här30. Vi bekräftar först att den diskreta modell som beskrivs ovan kan reproducera detta beteende innan vi använder denna modell för att kvantifiera de mönster som produceras.

Experimentella resultat av Matsushita & Fujikawa12 (översta raden) med motsvarande modellsimuleringar (nedre raden). Här visas a) större grenar som avskärmar mindre grenar från näring (fenomen I), b) två kolonier som såtts nära varandra och som verkar stöta bort varandra (fenomen II) och c) en enskild koloni som växer mot näringskällan på den högra sidan av petriskålen (fenomen III). Simuleringar av d) avskärmande grenar, e) två kolonier i nära anslutning till varandra och f) tillväxt med näringsämnet på höger sida beräknas med hjälp av den gitterbaserade modellen. Fröcellerna är markerade med en röd prick. Simuleringarna beräknades på gitter med dimensionerna L x = L y = 200 med parametrarna s = 3 och c0 = 1, vilket ger ett värde på Δ i samma storleksordning som i experimenten. Figurerna 2(a), 2(b) och 2(c) är återgivna från Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita and Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, med tillstånd från Elsevier.

Samspelet mellan cellerna och näringsämnet kan kvantifieras i stort sett genom att jämföra den relativa spridningshastigheten för dessa två kvantiteter. Kolonins tillväxt mäts genom att beräkna den genomsnittliga förändringshastigheten i koloniområdet Δ m sett uppifrån, som har samma enheter som en diffusivitet. Denna kvantitet kan lätt beräknas från en experimentell bild eller från simulerade data, t.ex. från den diskreta modellen. Spridningen av näringsämnet Δ n antas vara diffusiviteten hos glukos eftersom detta är vanligt förekommande som näringskälla och det är liten skillnad mellan diffusiviteten hos olika näringsämnen. Det är känt att glukosens diffusivitet i vatten är ungefär \({D}_{0}=4,03\times {10}^{-2}\)mm2 min-1, baserat på experimentella observationer36. För glukos i en agargel med låg densitet ges diffusiviteten av

där w är viktprocenten av agar37. Om man antar att w = 0,3 % är diffusiviteten 4,01×10-2 mm2 min-2, vilket är det värde som används i resten av denna studie. Diffusiviteten förändras föga med mängden agar, och därför har w en försumbar inverkan på resultaten. Från dessa kvantiteter beräknar vi förhållandet

vilket ger ett dimensionslöst mått på den relativa spridningshastigheten. Vid små värden på Δ diffunderar näringsämnena på en snabbare tidsskala än celltillväxten, vilket innebär att alla lokala variationer i näringskoncentrationen försvinner utan att påverka kolonimorfologin. Ett värde på Δ som är 1 eller större indikerar att celltillväxten sker med en hastighet som är minst lika stor som näringen diffunderar, och lokala variationer i näringskoncentrationen kan ha en inverkan på kolonimorfologin. Av de tre experimentella bilderna är det bara bilden av riktad tillväxt som har tillräcklig information om både skala och tid som krävs för att beräkna Δ. Från denna bild finner vi att Δ ≈ 0,23. Att ställa in s = 3 och c0 = 1 i modellen ger lösningar med värden på Δ mellan 0,3 och 0,5, vilket är av samma storleksordning som de experimentella resultaten och därmed ger en lämplig jämförelse. Dessa parametervärden används i resten av detta underavsnitt. Beteendet i vart och ett av de tre fallen kvantifieras ytterligare med hjälp av rumsliga index, som beskrivs nedan, i likhet med tillvägagångssättet i Binder et al.38. Vid varje simulering används ett gitter med dimensionerna L x = L y = 200, vilket är tillräckligt stort för att producera egenskaper med tillräcklig upplösning samtidigt som det är beräkningseffektivt.

För att undersöka grenavskiljning (fenomen I) sås näringsämnena ut jämnt och slumpmässigt över domänen och en enda cell placeras i mitten av gittret. Simuleringen körs tills den totala celltätheten når 0,2, vilket illustreras av den representativa kolonin i figur 2. Kolonin har stora grenar som utgår från platsen för den första centrala cellen, med kortare grenar däremellan som har avskärmat sig från näring från de större grenarna, och uppvisar en betydande ojämn tillväxt. Detta stämmer överens med det beteende som observerades av Matsushita & Fujikawa12. Morfologin kan kvantifieras genom att först räkna vinklarna till varje cell mätt moturs från en viss referensvinkel med ursprunget placerat vid massans centrum. Räkningarna skalas med de förväntade värdena för celler som fördelas jämnt slumpmässigt, och vinkelindexet för ojämn tillväxt I θ definieras som standardavvikelsen för de skalade räkningarna, så att större värden på I θ indikerar större nivåer av ojämn tillväxt. Den experimentella bilden har index 0,18, medan simuleringen har index 0,2, vilket indikerar att de två stämmer väl överens.

För fallet med avstötande kolonier (fenomen II) placeras näringsämnet återigen jämnt slumpmässigt över området. Två fröceller placeras vertikalt centrerade inom domänen, var och en en åttondel av domänbredden bort från centrum horisontellt så att cellerna är separerade med en fjärdedel av den totala domänbredden. Simuleringen beräknas tills den totala celltätheten når 0,2. En typisk simulering visas i figur 2, som visar gapet mellan de två kolonier som observerats av Matsushita & Fujikawa12. Avstötande kolonier kan kvantifieras genom att räkna det totala antalet celler ν och antalet celler ν c mellan de två fröcellerna i slutet av simuleringen. Indexet för avstötning definieras då som I c = 1 – ν c /ν, som är nära 0,5 när de två kolonierna växer jämnt, mindre än 0,5 när en klyfta bildas och större än 0,5 när kolonierna visar en preferens för tillväxt mot varandra. Fröcellernas placering för varje koloni i försöksbilden approximeras genom att dra linjer längs grenarna och identifiera var dessa skär varandra. Den experimentella bilden och simuleringen har index 0,19 respektive 0,27, vilket tyder på att båda producerar liknande tillväxtmönster med en betydande klyfta mellan de två kolonierna.

Riktad tillväxt (fenomen III) simuleras genom att inledningsvis placera alla näringsämnen i domänens högra kolumn, med en enda cell placerad i domänens mitt. Simuleringen beräknas sedan tills celltätheten når 0,1. En typisk koloni visas i fig. 2, som nära liknar det experimentella resultatet från Matsushita & Fujikawa12. För att mäta bias mot en sida av domänen beräknar vi andelen I b av celler på domänens högra sida i förhållande till det totala antalet celler, så att I b ∈ . Värden på indexet I b nära 0,5 indikerar liten bias, medan I b < 0,5 indikerar bias mot den högra sidan och I b < 0,5 indikerar bias mot den vänstra sidan. Den experimentella bilden har index 0,92, vilket nära överensstämmer med simuleringens index 0,93. I båda fallen indikerar indexen en stor tillväxtbias mot den ursprungliga näringsplatsen.

Som Ginovart et al.30 konstaterade visar de goda kvalitativa överensstämmelserna mellan de experimentella bilderna och simuleringarna att DLG ensamt kan åstadkomma screening, avstötning och riktad tillväxt av B. subtilis-kolonier. Vi har ytterligare förstärkt denna jämförelse genom att använda en kvantitativ jämförelse mellan experimenten och en matematisk modell. Vi förväntar oss således att dessa fenomen är närvarande när DLG påverkar morfologin, medan frånvaron av dessa egenskaper tyder på att andra mekanismer är ansvariga för tillväxtmönstret. Avgörande är att överensstämmelsen mellan den diskreta modellen och den modell som föreslagits av Ginovart et al. visar att den diskreta modell som används här ger en tillfredsställande representation av DLG och därmed kan användas för att kvantifiera detta beteende.

Inducerande av DLG

Efter att ha visat att den diskreta modellen kan replikera DLG-beteendet kvantifierar vi här dessa fenomens beroende av modellens parametrar, så att vi kan förutsäga när DLG-effekter kommer att uppstå. Kolonier simuleras återigen på ett gitter med dimensionerna L x = L y = 200 med samma tre startvillkor och stoppkriterier som i föregående underavsnitt. Simuleringarna upprepas 50 gånger för varje par av näringssteg s = 1, 5, …, 37 och initiala koncentrationer c0 = 1, 2, …, 7. För varje parameterpar beräknar vi det relevanta genomsnittliga indexet över de 50 realiseringarna.

För att undersöka grenutredningen (fenomen I) betraktar vi kolonier som vuxit från en enskild cell i ett enhetligt näringsfält, med motsvarande värden medelindexvärden \({\bar{I}}_{\theta }\) över de 50 realiseringarna som visas i fig. 3. De största värdena för \({\bar{I}}_{\theta }\) uppstår när både s och c0 är små, vilket beror på två faktorer. För det första, eftersom spridningen av näringsämnen, i praktiken s, är liten i förhållande till celltillväxthastigheten, uppstår fluktuationer i näringsnivåerna över hela området. För det andra innebär den låga initiala näringskoncentrationen c0 att dessa fluktuationer skapar områden där näringsnivån är för låg för att stödja celltillväxten. När antingen s eller c0 är större kan minst ett av dessa förhållanden inte uppstå och värdet av \({\bar{I}}_{\theta }\) blir mindre, vilket tyder på att DLG inte längre har något betydande inflytande på kolonin. Dessa resultat tyder alltså på att oenhetliga mönster endast kan uppstå när både näringsdiffusionen, i förhållande till celltillväxthastigheten, och näringskoncentrationen är liten.

Mätningar av DLG-effekter i simulerade mikrobiella kolonier. Alla simuleringar är beräknade med hjälp av den gitterbaserade modellen med en rad olika näringssteg s och initiala koncentrationer av näringsämnen c0. Här visas (a) medelindex \({\bar{I}}_{\theta }\) för grenavskiljning (fenomen I), (b) medelindex \({\bar{I}}_{c}\) för avstötning av kolonier (fenomen II) och (c) medelindex \({\bar{I}}_{b}\) för riktad tillväxt (fenomen III).

Samma beteende observeras för det avstötande fallet (fenomen II), vilket framgår av det genomsnittliga indexet \({\bar{I}}_{c}\) som ritas upp i fig. 3. De största värdena på indexet finns vid små värden på s och c0, vilket sker av samma skäl som för \({\bar{I}}_{\theta }\).

Beteendet för riktad tillväxt (fenomen III) är annorlunda, vilket framgår av det genomsnittliga indexet \({\bar{I}}_{b}\) som visas i fig. 3. Vid små värden på s är indexet \({\bar{I}}_{b}\) stort och varierar lite med c0. När s ökar minskar \({\bar{I}}_{b}\) och visar ett större beroende av c0, med större värden på \({\bar{I}}_{b}\) vid lägre c0. Det intervall av parametervärden över vilket riktad tillväxt kan observeras är mycket större än för de andra två DLG-fenomenen. Om riktad tillväxt inte förekommer kommer inte heller de andra två egenskaperna att göra det, och riktad tillväxt är därför en användbar första kontroll av DLG som är enkel att mäta. Denna funktion kommer att användas för att testa DLG under resten av detta arbete.

Kontinuumsmodell

Uppkomsten av DLG-fenomen beror både på näringskoncentrationen och diffusiviteten hos de två arterna. Medan indexen mäter dessa fenomens beroende av antalet diskreta näringssteg s och den ursprungliga näringskoncentrationen c0, kunde värdet på Δ endast beräknas från de simulerade uppgifterna snarare än anges som indata till modellen. När experimentella data beaktas är det dock naturligt att karakterisera den relativa spridningen av cellerna och näringsämnena med hjälp av Δ, eftersom detta lätt kan mätas från experimentella bilder. Vi introducerar här ett deterministiskt system av reaktions-diffusionsekvationer som modellerar celltätheten och näringskoncentrationen och som gör det möjligt att specificera den relativa spridningen av varje kvantitet, vilket är likvärdigt med att ställa in Δ. Även om denna modell inte lämpar sig för att fånga de fina egenskaper som observeras i figur 2, kan den replikera en riktad tillväxt mot en näringskälla (fenomen III), som visade sig uppkomma inom det största parametervärdet. Vi fokuserar därför på denna aspekt av DLG, som fungerar som ett lätt mätbart tecken på att DLG förekommer.

Vi betraktar en endimensionell domän, vilket är tillräckligt för att illustrera modellens allmänna beteende29,32,39. Med hjälp av den dimensionslösa positionen x, tiden t, celltätheten n(x,t) och näringskoncentrationen g(x,t), som beskrivs i avsnitt 3, reduceras de styrande ekvationerna till

Parametern D = D m /D n är förhållandet mellan cellens diffusivitet D m och näringsämnets D n . Detta liknar definitionen av Δ (2), där celldiffusionen används i stället för den uppmätta förändringshastigheten i koloniområdet. Den första termen på höger sida i båda ekvationerna representerar diffusionens bidrag, medan de andra termerna representerar förbrukningen av näringsämnen respektive tillväxten av nya celler, där c är den dimensionslösa mängden näringsämnen som förbrukas per ny cell.

Som utgångsvillkor placeras cellerna i centrum av domänen med näringsämnet snedvridet till höger enligt

där N kan tolkas som en dimensionslös koncentration av näringsämnen. För att illustrera det allmänna beteendet visas initialförhållandena för N = 1 i figur 4.

Resultat från den endimensionella reaktionsdiffusionsmodellen. (a) Initialtillståndet för N = 1 visar att cellerna är koncentrerade i centrum av domänen med näringsämnet till höger. (b) De maximala värdena för I b fram till tiden t = 1, plottat mot bas 10-logaritmen av D och N, tyder på att DLG endast förekommer vid vissa parametervärden. Två representativa exempel visas markerade. (c) Vid det största värdet av I b när D = 10-6 och N = 1 är cellerna fortfarande nästan symmetriska kring x = 0, medan näringskoncentrationen har blivit effektivt enhetlig. (d) Användning av D = 10-0,5 och N = 105 resulterar i en betydande förskjutning mot höger sida, där näringsämnet ursprungligen var koncentrerat.

Om de typiska parametervärden som anges i avsnitt 3 betraktas som fasta, varierar värdet på N endast på grund av den fysikaliska koncentrationen av näringsämnet. Om man betraktar ett medium som endast innehåller näringsämnen, som representerar en maximal koncentration, finner man att värdet på N inte kan vara högre än ungefär 105. Lösningarna beräknas därför för 1 ≤ N ≤ 105. Medan typiska experimentella observationer tyder på att 10-3 ≤ D ≤10-1, tar vi hänsyn till värden för 10-6 ≤ D ≤103 för att teoretiskt undersöka hur beteendet förändras med D. För olika värden på dessa parametrar beräknar vi det maximala värdet av I b som observerats fram till tiden t = 1. Detta motsvarar ungefär 119 dagars tillväxt, vilket, även om det är större än typiska experimentella tider, säkerställer att det maximala värdet av I b observeras under simuleringen. De beräknade indexen I b visas i figur 4 med en logaritmisk skala i bas 10 för båda axlarna. För log(N) < 1 finns det liten eller ingen bias i cellernas tillväxt, mätt med I b . Vid större värden på N beror den observerade biasmängden på värdet på D, med ett maximum i närheten av (D,N) = (1, 105). Detta D-värde motsvarar lika stor cell- och näringsdiffusion, och runt detta värde är det möjligt att observera en snedvridning av tillväxten för värden på N som är så små som 101,5. Under typiska experimentella förhållanden har N storleksordningen 2, vilket indikerar att DLG-effekter är mest sannolika att observeras när D är nära en enhet.

Det varierande beteendet illustreras ytterligare genom att betrakta fördelningarna från två kontrasterande exempel. I varje fall visas lösningen vid den tidpunkt som motsvarar den maximala cellförskjutningen. För D = 10-6 och N = 1, som visas i figur 4, har näringskoncentrationen blivit effektivt jämn innan celltätheten kan utveckla någon tydlig förskjutning mot den högra sidan, där näringen ursprungligen var koncentrerad. Om man däremot tar D = 10-0,5 och N = 105, som också visas i figur 4, visar cellerna en tydlig preferens mot domänens högra sida.

Analysen av kontinuummodellen tyder på att om \(D\ll 1\), så kommer den riktade tillväxten, och därmed eventuella DLG-effekter, endast att inträffa vid värden på N som är minst lika stora som 103. Eftersom uppskattningar visar att N har storleksordningen 2, tyder detta på att DLG endast kommer att observeras när D är nära en enhet, vilket framgår av fig. 4. Detta kan också illustreras med hjälp av fysiska parametrar. Med hjälp av de parametervärden som anges i avsnitt 3 skulle mikrober med diffusivitet \({D}_{m}=3\times {10}^{-2}\})mm2 min-1 placerade i en miljö med maximal ursprunglig näringskoncentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\times {10}^{-3}\}\)g mm-2 ungefär motsvara de dimensionslösa värdena D = 0,75 och N = 104. Utifrån figur 4 kan man förvänta sig att denna art skulle växa mot en näringskälla och därmed uppvisa ett DLG-beteende. Om samma mikrober placeras i en miljö med maximal näringskoncentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\ gånger {10}^{-6}\)g mm-2, skulle värdet på N sjunka till 10 och en snedvriden tillväxt skulle inte längre observeras. Resultaten i det här avsnittet ger således en ram för att identifiera när DLG förväntas inträffa baserat enbart på uppskattningar av D och N.

Experimentella jämförelser

Efter att ha undersökt modellens förutsägelser använder vi nu dessa för att identifiera den dominerande tillväxtmekanismen i mikrobiella kolonier. Vi betraktar de tre representativa experimentella exempel som visas i figur 1: två kolonier av bakterien B. subtilis och en koloni av S. cerevisiae. Eftersom vi inte känner till det lämpliga värdet på diffusionskvoten D, som krävs enligt reaktions-diffusionsmodellen, karakteriseras tillväxten i stället av den relativa spridningen Δ (2). Denna parameter representerar förhållandet mellan den genomsnittliga förändringshastigheten i koloniområdet, sett uppifrån, och glukosens diffusionsförmåga och kan mätas från bilderna. Eftersom näringsämnet är jämnt fördelat och endast en enda koloni odlas, förväntas eventuell DLG i dessa exempel manifestera sig som oregelbunden tillväxt med grenutglesning (fenomen I).

De beräknade värdena för tillväxthastigheten Δ m anges i tabell 1, tillsammans med motsvarande relativa hastigheter Δ. Dessa värden visar att B. subtilis-kolonierna växer två storleksordningar snabbare än jästkolonin och en storleksordning långsammare än glukosens diffusionsförmåga. Om man använder typiska värden för den ursprungliga näringskoncentrationen tyder det på att experimenten motsvarar ett värde på N som har storleksordningen 2. Att matcha denna uppskattning och värdena för Δ med modellresultaten från figur 4 tyder på att B. subtilis motsvarar en regim där riktad tillväxt på grund av DLG kommer att inträffa. Eftersom denna uppskattning gjordes genom att mäta cellproliferationshastigheten p i en koloni av S. cerevisiae, som sannolikt är mindre än motsvarande värde för bakterier, förväntas detta vara en underskattning av N och ett större värde på N ökar sannolikheten för att observera DLG. Däremot har S. cerevisiae-kolonin ett Δ med storleksordningen -3, vilket tyder på att näringsämnet diffunderar på en mycket snabbare tidsskala än celltillväxten. Följaktligen förväntas alla lokala variationer i näringskoncentrationen försvinna innan de påverkar koloniens morfologi. Detta tyder på att morfologin inte påverkas av DLG. Trots den stora likheten mellan formen på bakterie- och jästkolonier i näringsfattiga miljöer beror dessa två morfologier alltså på olika fenomen. Bakteriekolonier växer på en tillräckligt snabb tidsskala för att näringsdiffusionen kan begränsa tillväxten, vilket resulterar i ett oregelbundet mönster. Den mycket långsammare tillväxten hos jästkolonier innebär att DLG inte kan förekomma och i stället måste de ojämna kolonimorfologier som uppstår i näringsfattiga miljöer enbart bero på pseudohyfisk tillväxt.

Vi sökte ytterligare bekräftelse på dessa resultat genom att testa riktad tillväxt (fenomen III) i kolonier av S. cerevisiae, genom att efterlikna den uppställning som användes av Matsushita & Fujikawa12 och i simuleringarna40. En petriskål fylldes med syntetisk lågammoniumdextros (SLAD) med näringsämnet placerat i mitten av petriskålen. Jästceller såddes på olika avstånd från centrum och fotograferades efter 16 dagars tillväxt. Ytterligare experimentella uppgifter finns i avsnitt 3. Både glukos och ammoniumsulfat användes som begränsat näringsämne, och representativa bilder för var och en av dem visas i figur 5. Bilderna är orienterade så att mitten av petriskålen, där näringsämnena placerades, är på höger sida. Diffusiviteten för ammonium i vatten är ungefär 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Eftersom detta är av samma storleksordning som glukosens diffusivitet förväntas varje näringskälla resultera i ett liknande värde på Δ. Ingen av kolonierna uppvisar någon märkbar bias i tillväxten i någon riktning, och båda producerar biasindex I b som är nästan exakt lika med 0,5. De effektiva diffusiviteterna Δ m och de dimensionslösa diffusiviteterna Δ för varje försök anges i tabell 2. I båda fallen har Δ storleksordningen -3, vilket indikerar att riktad tillväxt inte bör observeras och stämmer överens med resultaten från de tidigare experimenten.

Bilder från försöken med riktad tillväxt med S. cerevisiae. Bilderna är orienterade så att motsvarande näringsämne finns på höger sida av kolonin, vilket indikeras av den vertikala texten. Kolonierna odlades på (a) SLAD-G med glukos tillsatt till höger och (b) SLAD-N med ammoniumsulfat tillsatt till höger. Skalstängerna representerar 5 mm.

Ett ytterligare bevis för tillväxtsättet ges av beteendet nära koloniernas kant. Det finns tydliga tecken på ojämn tillväxt runt gränsen av den koloni som odlats på SLAD-N men inte på den koloni som odlats på SLAD-G. Om detta mönster berodde på DLG skulle vi förvänta oss ett liknande beteende på båda medierna. Det är dock känt att diploida jästsvampar, som den AWRI796-stam som användes i detta experiment, övergår till pseudohyfisk tillväxt när de berövas kväve2 , t.ex. med SLAD-N. Detta tyder på att den ojämna tillväxt som observeras i jästkolonier, såsom den som visas i figur 1, beror på pseudohyfisk tillväxt och inte på DLG.