INLEDNING

Yoghurt är en mejeriprodukt som framställs genom jäsning av mjölk med Lactobacillus spp. Numera är yoghurts terapeutiska, profylaktiska och näringsmässiga egenskaper allmänt accepterade (Boor, 2001). När probiotika administreras i tillräcklig mängd ger de hälsofördelar för värden och ökar den mikrobiella balansen (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Probiotika är alltså levande, icke-patogena, vänliga mikroorganismer som spelar fördelaktiga roller i värdens mikrofloraavdelning (Schrezenmeir och de Vrese, 2001). Mjölksyrabakterier (LAB) är den viktigaste probiotiska gruppen av mikroorganismer, särskilt Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. och Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Dietära och terapeutiska kvaliteter hos mjölkprodukter bestäms av probiotiska mikroorganismer (Boor, 2001).

Yoghurt är en potentiell källa till probiotiska Lactobacillus spp. Yoghurt är också känd som det rikaste probiotiska kontaminerande livsmedlet. Mjölkproduktens näringsvärde ökar genom probiotiska mikroorganismer och metaboliter som produceras som ett resultat av fermenteringen. Regelbundet intag av yoghurt minskar överflödigt fett från levern och ökar genom utsöndring. Det är också nödvändigt för dem som lider av hjärtsjukdomar, ateroskleros, högt blodtryck och inflammation. Magsaft som utsöndras av yoghurt leder till en hög matsmältningsförmåga. Den gynnsamma effekten av probiotiska mikroorganismer, särskilt Lactobacillus sp. som finns i mjölkprodukter vilket bevis rapporterats vidare har många forskare studerat effekterna av probiotiska mikroorganismer mot patogena organismer med hjälp av olika metoder (Mercenier et al., 2003).

Lactobaciller tillhör mjölksyrabakterierna vars primära jäsningsändprodukt är mjölksyra. De är kommersiellt viktiga bakterier med många olika användningsområden både inom livsmedels- och icke-livsmedelsindustrin på grund av deras ”Generally Recognized As Safe”-status (GRAS). Laktobaciller har studerats ingående för deras molekylärbiologi i syfte att förbättra deras specifika fördelaktiga egenskaper (Pouwels och Leer, 1993).

Probiotikas verkningssätt bygger på de probiotiska bakteriernas förmåga att binda patogener i tarmepitelvävnad. Antipatogen verkan av probiotika består i produktion av mjölksyra som sänker pH, interagerar med de toxiner som produceras av patogener med produktion av väteperoxid och syntesbakteriocin (Corcionivoschi et al., 2010).

En effektiv probiotisk produkt kräver korrekt identifiering och karakterisering av en bakterieart som används. Valet av probiotiska organismer som kan vara till hjälp terapeutiskt och näringsmässigt skulle baseras på specifika egenskaper (Fuller, 1989; Quewand och Vesterlund, 2004).

Syftet med denna forskning var att samla in yoghurt från olika regioner i Bangladesh och identifiering av laktobaciller genom bakteriologisk såväl som genusspecifik PCR och analys av deras probiotiska egenskaper efter störning av sjukdomsframkallande bakterietillväxt.

MATERIALER OCH METODER

Provsamling och isolering av mjölksyrabakterier (LAB): Två typer av yoghurtprover samlades in från olika stormarknader i Chittagong och Bogra i Bangladesh som var sura (prov M1, M2 och M3) och söta (prov S2) i smaken. Proverna förvarades omedelbart efter insamlingen i kylskåp med låg temperatur (4 °C) på ett aseptiskt sätt för att skydda mot kontaminering och försämring. Lactobacillus spp. isolerades från yoghurtproverna genom lämplig utspädning med 0,9 % saltlösning. MRS-buljong (Man, Rogosa och Sharpe) och MRS-agar (Man, Rogosa och Sharpe) användes för tillväxt av organismen. Mediernas pH-värde justerades till 6,5. Plattorna inkuberades aerobt vid 37 °C i 48 timmar. Slutligen isolerades en enskild koloni av Lactobacillus genom att observera kolonimorfologin och vissa biokemiska tester, t.ex. gramfärgning, katalas- och oxidastest. Väl isolerade kolonier plockades upp och överfördes till MRS-buljong för anrikning av Lactobacillus vid 37 °C.

Identifiering av mjölksyrabakterier (LAB) genom bakteriologisk analys: Identifiering utfördes enligt de metoder som beskrivs i Bergeys manual of systemic bacteriology. Utan användning av anaeroba förhållanden växte alla stammar bra på MRS agar vid 37°C i 48 timmar för selektiv utväxt av laktobaciller. Från lämpliga utspädningar plockades en representativ koloni som preliminärt identifierades som laktobaciller efter Gramfärgningsreaktion, koloniutseende, cellmorfologi, katalastest, oxidasetest, indoltest, metylröttest, voges-proskauer-test, citratutnyttjandetest och kolhydratfermenteringsmönster enligt Bergeys manual (Hensyl, 1994).

DNA-extraktion från isolat: DNA extraherades från 4 prover som isolerats från yoghurt enligt den klassiska värmetröskelmetoden (Salehi et al., 2005). Ren bakteriekultur från MRS agar slant subkulturerades i MRS buljongmedium varifrån 1,5 mL buljongkultur togs i eppendorfrör och centrifugerades vid 10 000 rpm i 5 min. Därefter kastades supernatanten och pelleten samlades upp. Cirka 200 μL autoklaverat avjoniserat vatten tillsattes till pelletsen och löstes upp genom fingerskarvning. Eppendorfrörets lock genomborrades med en steril nål och därefter kokades röret i vattenbad vid 100 °C i 10 minuter. Strax efter kokningen förvarades eppendorfröret på is i 10 minuter och centrifugerades sedan vid 10 000 rpm i 10 minuter. Därefter samlades 100-150 μL supernatant som innehöll bakteriellt kromosomalt DNA upp.

Genusspecifik PCR-amplifiering: För att bestämma alla fyra isolatens tillhörighet till genusnivå utfördes PCR med Lactobacillus genusspecifika primerset LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) och R16-1 (5′-CTTGTACACACACCG CCCGTCA-3′), designade av Dubernet et al. PCR-analysen gjordes baserat på 16-23S ribosomalt RNA intergenic spacer region enligt tidigare beskrivning (Dubernet et al., 2002).

Reaktionsblandningen (20 μL) innehöll 1 μL (100 ng μL1) av varje primer tillsatt med 10 μL 10× PCR Master Mix, 6 μL PCR-vatten och 2 μL mall. Körningsbetingelserna var inledande denaturering vid 95 °C i 5 minuter, följt av 30 cykler bestående av denaturering vid 95 °C i 30 sekunder, glödgning vid 55 °C i 30 sekunder, förlängning vid 72 °C i 30 sekunder och ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 7 minuter. Produkterna förvarades vid 4 °C fram till analysen. De amplifierade produkterna genomgick elektrofores i 1 % agarosgeler i TAE-buffert (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA, pH 8,2). Gelen färgades med ethidiumbromid (5 μg mL1) och visualiserades under UV-transilluminator (Biometra GmBH, Tyskland).

Analys av probiotiska egenskaper:

NaCl-toleranstest: Probiotikans egenskaper bestämdes genom att analysera följande tester:

NaCl-toleranstest: För bestämning av NaCl-tolerans odlades isolerade laktobaciller i MRS-buljong innehållande nio provrör som justerades med olika koncentrationer av NaCl (1-9 %). Efter autoklavering i 15 minuter i 15 Ibs tryck vid 121°C inokulerades varje provrör med 10 μL övernattkultur av Lactobacillus och inkuberades anaerobt vid 37°C i 24 timmar. Efter 24 timmars inkubation mättes bakterietillväxten med hjälp av en spektrofotometer vid 560 nm (Graciela och Maruia, 2001).

Gallesalttoleranstest: Bakteriekulturernas tillväxthastighet bestämdes i MRS-buljong som innehöll olika nivåer (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 och 0,5 %) av gallsalter. Nyberedda kulturer inokulerades (1 %) i mediet och inkuberades vid 37 °C i 24 timmar under anaeroba förhållanden. Därefter mättes den optiska densiteten för varje prov med en spektrofotometer vid 560 nm (Graciela och Maruia, 2001).

Bestämning av optimalt pH för tillväxt: För bestämning av optimalt pH för tillväxt inokulerades 100 μL färsk Lactobacillus-kultur över natten i provrör innehållande MRS-buljong med varierande pH från 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 och 8,0. För att bestämma pH-värdet på tillväxten användes acetatbuffert (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5), Tris-HCl-buffert (pH-7) och boratbuffert (pH-8). Den inokulerade buljongen inkuberades i anaerobt tillstånd i 24 timmar vid 37 °C. Efter inkubationen mättes bakterietillväxten med hjälp av en spektrofotometer vid 560 nm mot oinokulerad kontrollbuljong.

Kvantifiering av organisk syra och bestämning av pH-värde: Enligt Hoque et al. (2010) utfördes kvantifiering av organiska syror som producerades av isolaten och bestämning av deras pH-värden. MRS-buljongen kompletterad med 10 % skummjölk inokulerades med 1 % (v/v) eller 100 μL övernattningskultur av isolaten och inkuberades i anaerobt tillstånd vid 37 °C i 72 h. Fermenterade prover samlades in var 24:e, 48:e och 72:e timme och vätskor av koagulerad mjölk separerades genom filtrering. Efter filtrering registrerades pH i den separerade vätskan med hjälp av en pH-mätare med digital elektrod och kvantifiering av organisk syra gjordes genom titrering med 0,1 N NaOH med fenoftalien som pH-indikator (Hoque et al., 2010).

Screening av interferens med patogena bakterier: Den antibakteriella aktiviteten hos de isolerade Lactobacillus spp. mot vissa patogena bakterier bestämdes genom modifierad agar overlay-metod (Aween et al., 2012). Åtta olika humanpatogener, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli och Shigella sonnei användes i denna studie som testpatogener. Den antibakteriella aktiviteten karakteriserades vidare genom att bestämma om den var bakteriostatisk eller bakteriedödande. Testet utfördes genom svabbning av den tillväxthämmande zonen. Svabben ströks på en näringsagarplatta och inkuberades aerobt vid 37 °C i 72 timmar. Närvaron av tillväxt i näringsagarplattan tolkades som en hämmande aktivitet, dvs. bakteriostatisk, medan ingen tillväxt tolkades som bakteriedödande.

RESULTAT OCH DISKUSSION

Identifiering av bakterier genom bakteriologiska och biokemiska tester: De fyra isolaten odlades i Man, Rogosa and Sharpe (MRS) medium vid pH 6,5. Alla isolat producerades små, oregelbundna och runda former med glänsande vitaktig krämig eller brunaktig färg som morfologiskt liknade Lactobacillus spp.

Därefter undersöktes alla isolat i ljusfältsmikroskop för att observera deras mikroskopiska egenskaper. Dessa isolat var grampositiva, korta och medelstora stavformade icke-sporbildande bakterier (fig. 1a-d), vilket tyder på att de tillhör Lactobacillus spp. (Thamaraj och Shah, 2003).

Därutöver utfördes vissa biokemiska tester såsom katalastest, oxidastest, indoltest, Methyl Red (MR)-test, Voges Proskauer (VP)-test, citratutnyttjandetest och kolhydratfermenteringsmönster enligt Bergeys manual systematic bacteriology (Hensyl, 1994).

Isolaten visade sig vara katalas- och oxidasnegativa och i IMViC-testerna (indol, metylrött, Voges Proskauer, citratutnyttjande) visade sig alla isolat också vara negativa, vilket därmed kan bekräfta att isolaten var Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al, 2010).

I denna studie kunde alla fyra isolaten fermentera 11 olika kolhydrater, dvs. glukos, sackaros, fruktos, laktos, xylos, ribose, galaktos, maltos, mannitol, rhamnos och dextros, vilket tyder på att de kan växa i en mängd olika livsmiljöer och utnyttja olika typer av kolhydrater. De sammanfattade resultaten av alla bakteriologiska och biokemiska tester presenteras i tabell 1. Alla dessa resultat är relevanta för resultaten från Chowdhury et al. (2012).

Molekylär identifiering genom genusspecifik PCR: I den här studien använde vi en genusspecifik primer som framställts genom att analysera likheterna mellan nukleotidsekvenserna i spacer-regionen mellan 16- och 23S ribosomalt RNA-gener från Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). Specificiteten hos denna genusspecifika primer i kombination med en universell primer testades mot 23 Lactobacillus-stammar av olika ursprung. PCR-produkterna kördes genom gelelektrofores i 1 % agaros och visualiserades med UV-transilluminator. För varje prov (M1, M2, M3 och S2) hittades ett förväntat skarpt band på 200 bp amplikon som motsvarar 16-23S rRNA intergenic spacer-regionen hos Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Således bekräftades alla fyra isolaten på genusnivå som Lactobacillus spp. Den negativa kontrollen utan någon mall gav inget band, vilket tyder på att alla fyra PCR-produkterna var korrespondens av mall-DNA (fig. 2).

Analys av probiotiska egenskaper: Probiotiska bakterier producerar en mängd olika ämnen med antibakteriella egenskaper, inklusive organisk syra, H2O2, bakteriociner som påverkar bakteriemetabolismen eller toxinproduktion (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

För att kunna göra detta måste de kunna stå emot ogynnsamma förhållanden i tarmen som NaCl och gallsalt.

NaCl-toleranstest: Isolatet Lactobacillus spp. från yoghurt kunde tolerera 1-9 % NaCl. För att bestämma isolatens NaCl-tolerans mättes den optiska densiteten vid 560 nm och data plottades. Isolat M1, M2, M3 och S2 växte bra i koncentrationen 1 % NaCl. Den maximala tillväxten (OD) för isolaten M1, M2, M3 och S2 var 1,420, 2,143, 1,662 respektive 2,207 i 1 % NaCl (fig. 3). Hög salttolerans är en önskvärd egenskap för organismer som ska användas som probiotika.

Det är känt att NaCl är ett hämmande ämne som kan hämma tillväxten av vissa typer av bakterier. I denna studie visade resultaten att Lactobacillus spp. isolerade från yoghurt kunde tolerera 1-9 % NaCl och optimal tillväxt observerades vid 1-5 % NaCl (Hoque et al., 2010).

Toleranstest för gallsalt: Isolerade Lactobacillus spp. kunde överleva i 0,05, 0,1, 0,15 och 0,3 % gallsyra. Den isolerade Lactobacillus spp. kunde också föröka sig i ovannämnda koncentrationer av gallsyra. Den optiska densiteten mättes vid 560 nm och data ritades ut. Alla isolat växer bra i 0,05 % gallsaltskoncentration. Den maximala tillväxten (OD) för isolaten M1, M2, M3 och S2 var 1,741, 2,213, 1,758 respektive 2,125. Tillväxthastigheten minskade med ökande gallsaltskoncentration (Fig. 4).

I detta experiment användes 0,05-0,3 % gallkoncentration som kan finnas i människans tarmkanal och den maximala koncentrationen av galla som finns i en frisk människa är 0,3 % (Graciela och Maruia, 2001). Det rapporteras att innan man väljer en probiotisk bakterie för mänsklig konsumtion måste den vara tolerabel mot 0,3 % gallkoncentration (Gilliland et al., 1984). Baserat på resultatet föreslås att dessa stammar kan ha potential att användas som probiotiska organismer eftersom alla isolat var resistenta och kunde växa i 0,3 % gallsaltkoncentration.

Bestämning av optimalt pH för tillväxt: De isolerade Lactobacillus spp. från yoghurt kunde växa i pH-områden från 4,0-8,0. Den optiska densiteten mättes vid 560 nm och data plottades. Den maximala tillväxten (OD) för isolaten M1, M3 och S2 var 2,201, 2,0619 respektive 2,237 vid pH 6,0 medan den maximala tillväxten för isolat M2 var 2,259 vid pH 6,5 (fig. 5). Isolaten kunde växa vid pH mellan 4,0 och 8,0 men den optimala tillväxten observerades vid pH mellan 5,0 och 6,5 när de odlades i MRS-buljong vid 37°C. Från denna studie kan man dra slutsatsen att tillväxten av Lactobacillus spp. minskar i ett visst skede när pH-koncentrationen ökar (Chowdhury et al, 2012).

Kvantifiering av organisk syra och bestämning av pH-värde: För kvantifiering av organisk syra användes titreringsmetoden.

Kvantifiering av organisk syra = V×N×D

där V är volymen NaOH, N är NaOH:s styrka och D är utspädningsfaktorn. Resultatet av produktionen av organisk syra presenteras i tabell 2.

Denna studie visar att produktionen av organisk syra ökade med inkubationstiden, men samtidigt sjönk mediernas pH-värde med den ökande syraproduktionen. Av resultatet (tabell 2) framgår att högsta syrahalt (1,9 %) och lägsta pH-värde (3,64) observerades efter 72 timmars inkubation vid 37 °C för probiotisk Lactobacillus isolerad från Bogra-yoghurt. Andra probiotiska bakterier isolerade från yoghurt från olika stormarknader i Chittagong uppvisade den högsta syrahalten (1,83, 2,11 och 2,11 %) och det lägsta pH-värdet (3,9, 3,68 och 3,65) efter 72 timmars inkubation.

Det finns en mindre variation i produktion av organisk syra av laktobaciller på grund av deras regionala skillnader, vilket indikerar att dessa isolat är något klimat- och miljöberoende (Hoque et al, 2010).

Screening av interferens med patogena bakterier: Probiotika inklusive Lactobacillus, Bifidobacterium och Streptococcus spp. är kända för att vara hämmande för tillväxten av ett stort antal tarmpatogener hos människor. Förutom de gynnsamma effekterna mot sjukdomar som orsakas av en obalans i tarmmikrofloran har Dunne et al. (2001) och Wollowski et al. (2001) rapporterat flera experimentella observationer av bakterier mot utvecklingen av tjocktarmstumörer.

I denna studie undersöktes de utvalda 4 isolaten enligt deras antibakteriella aktivitet mot olika patogena bakterier såsom Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli och Shigella sonnei som är associerade med livsmedelsburna sjukdomar. Jämförelsen av deras hämning (i mm) mot åtta testpatogener visas i tabell 3.

De experimentella resultaten visade att den högsta hämmande aktiviteten hos isolat M1 uppvisades mot Bacillus cereus (51,20±1,22 mm) och den lägsta hämmande zonen var (23,46±1,00 mm) mot Shigella sonnei efter 72 timmars inkubation. Den högsta diametern på inhiberingszonen för isolat M2 visades mot E. coli (38,43±1,00 mm) och den lägsta zonen (20,10±1,00 mm) mot Bacillus megaterium efter 72 timmars inkubation. På samma sätt uppvisade isolat M3 den högsta diametern av hämmande zon mot P. aeruginosa (42,90±1,20 mm) och den lägsta zonen (17,83±1,10 mm) mot S. aureus. Slutligen observerades i isolat S2 den högsta zonen mot E. coli (43,80±1,20 mm) och den lägsta zonen (21,63±1,10 mm) mot S. aureus efter 72 timmars inkubation. Resultaten avseende Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae och Escherichia coli befanns relevanta för resultaten från Chowdhury et al. (2012).

I den aktuella studien visade isolaten M1, M2, M3 och S2 tillfredsställande resultat när det gäller bakteriedödande och bakteriostatisk aktivitet. Isolat M1 var bakteriedödande mot Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei och bakteriostatisk mot Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus och E. coli. Isolat M2 var baktericid för Bacillus cereus, Shigella sonnei och bakteriostatisk för Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae och Escherichia coli. Isolat M3 var baktericid för Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium och Staphylococcus aureus och bakteriostatisk för Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa och Vibrio cholerae, Escherichia coli och Shigella sonnei och isolat S2 var baktericid för Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae och Shigella sonnei och bakteriostatisk för Bacillus megaterium och Escherichia coli.

KONKLUSION

I denna studie har Lactobacillus spp, isolerades och identifierades från selektiva regionala yoghurtar. För identifiering av bakterier utfördes flera bakteriologiska och biokemiska tester. Dessutom genomfördes en PCR med hjälp av genusspecifika primers (LbLMA-rev) och universella primers (primer R16-1) som motsvarar 16-23S rRNA intergenic spacer-regionen hos Lactobacillus spp. för att bekräfta den bakteriologiska identifieringen. De isolerade Lactobacillus spp. kunde tolerera hämmande ämnen som NaCl (1-9 %) och gallsalt (0,05-0,3 %) och kunde också överleva i alkaliska förhållanden (pH 8,0). Alla dessa isolat (M1, M2, M3 och S2) kunde utnyttja kolhydrater som glukos, xylos, sackaros, fruktos, galaktos, laktos, maltos, ribose, rhamnos, mannitol och dextros. Dessutom kunde de isolerade Lactobacillus spp. från alla fyra isolaten (M1, M2, M3 och S2) producera organisk syra i mjölk. Denna undersökning visar att det finns en mindre variation i Lactobacillus produktion av organisk syra på grund av deras regionala variation. Alla fyra isolaten (M1, M2, M3 och S2) uppvisade en tillfredsställande antibakteriell aktivitet mot åtta vanliga humanpatogena bakterier, och isolaten producerar extracellulärt bakteriocin. En probiotika måste kunna hämma patogena organismer och bör kunna tolerera de hårda förhållandena i människans tarm, t.ex. hög salthalt, lågt pH-värde och hög koncentration av gallsalter. Alla de isolerade Lactobacillus spp. uppfyllde dessa kriterier och kan därför betraktas som potentiella probiotika för människors hälsa.