Inrättandet av system för genetisk transformation har gjort det möjligt för forskare att transformera främmande DNA till filamentösa svampar och på så sätt få fram de önskade stammarna för industriella ändamål. Vi kan nu dra full nytta av svamparnas överlägsna sekretoriska förmåga och deras utmärkta effektivitet vid framställning av värdefulla metaboliter.

Protoplastmedierad transformation (PMT)

PMT är den vanligaste transformationsmetoden för svampar, som bygger på ett stort antal kompetenta svampprotoplaster. Principen är att använda vissa kommersiellt tillgängliga enzymer för att avlägsna svampens komplexa cellväggskomponenter för att generera protoplaster. Därefter används vissa kemiska reagenser (t.ex. PEG) för att främja fusionen av exogena nukleinsyror och protoplaster, vilket beskrivs närmare nedan. Komponenterna i svampens cellvägg är mycket varierande mellan olika stammar. Till och med beståndsdelarna i sporhusets hölje skiljer sig avsevärt från beståndsdelarna i hyferna från samma stam . Det finns därför ingen universell transformationsmetod som kan tillämpas på olika svampstammar. Beredningen av protoplasten kan knappast standardiseras. En del av svårigheterna beror på vår begränsade kunskap om hydrolaser i cellväggen. Utveckling av en optimerad PMT-metod för svampar kräver fortfarande betydande insatser.

PMT är en rutinmässigt använd transformationsmetod. Metoden har ständigt förbättrats för att uppnå högre effektivitet för genetisk transformation och för att rikta in lämpliga genloci genom genredigering. För att förbereda protoplaster krävs att cellväggen avlägsnas, vilket huvudsakligen uppnås genom enzymbehandling. Det har också rapporterats om andra metoder än enzymer för att bereda protoplaster, t.ex. fysikaliska metoder som slipning och supersoniska vågchocker . Dessa metoder används dock inte i någon större utsträckning på grund av de praktiska olägenheterna och den låga avkastningen av protoplaster. En sammanfattning av protoplastmedierade transformationsprotokoll för olika svamparter finns i tabell 1.

Grundläggande steg i PMT-metoden

PMT tillämpades först på Saccharomyces cerevisiae. Forskarna framställde protoplaster med det kommersiella snigelaset och använde sorbitol för att bevara protoplasterna. Senare tillämpades denna metod på filamentösa svampar, såsom Neurospora crassa och A. nidulans. Även om transformationsmetoderna har förbättrats är de grundläggande stegen i stort sett desamma. De grundläggande stegen i PMT-metoden visas i figur 1.

Grundläggande steg i den protoplastmedierade transformationen

Förberedelse av protoplasterna

Det första steget i protoplastförberedelsen är avlägsnande av cellväggen genom enzymatisk digestion. Svampens cellvägg består av glukan, mannan och kitin. Svampens cellväggsstruktur är mycket dynamisk, och cellväggen varierar under celldelningen och tillväxten hos svamparna, liksom vid sporspridning, hyfala förgreningar och bildandet av membranen. Cellväggskomponenterna är också olika i olika svamparter, varför olika enzymer bör användas i kombination. Det har rapporterats att valet av en lämplig enzymblandning är en nyckelfaktor vid protoplastberedning .

I allmänhet är hyferna känsliga för ett lämpligt enzym som hydrolyserar dess cellvägg under den logaritmiska fasen. I PMT-förfarandet för Neurospora bereds protoplasterna genom att hydrolysa de nyfödda hyferna (odling i 4-6 timmar vid 25-30 °C) . På samma sätt kan protoplaster också framställas med konidiosporer. För Aspergillus och Penicillium kan man till exempel välja groddsporer eller thalli .

Protoplaster är känsliga för osmotiskt tryck, och man bör se till att upprätthålla ett stabilt osmotiskt tryck för att hålla protoplasterna intakta under enzymolysen av cellväggarna. Osmotiska stabilisatorer (t.ex. sorbitol, natriumklorid och kaliumklorid) bör därför ingå i alla buffertar för protoplastberedning för att undvika att cellerna brister. Exempelvis används sorbitollösning med en koncentration på 0,8-1,2 M i protoplastberedningen av N. crassa , Aspergillus sp. och Trichoderma sp. för att upprätthålla den osmotiska stabiliteten hos protoplasterna. En sammanfattning av parametrar för protoplastberedning för några vanliga svamparter finns i tabell 2.

Upptag av exogent DNA

Lösningen som används för att suspendera protoplaster innehåller vanligtvis kalciumjoner och osmotiska stabilisatorer. Kalcium antas öppna kanaler i cytomembranet, vilket underlättar inträdet av exogent DNA i cellen, medan osmotiska stabilisatorer är nödvändiga för att upprätthålla protoplasternas morfologi. Vanligtvis tillsätts en viss mängd polyetylenglykol (PEG) tillsammans med renat DNA (som antingen kan vara cirkulärt dubbelsträngat DNA eller linjäriserat DNA). PEG är en vanligt förekommande cellfusionspromotor. Den kan bilda en molekylär bro mellan celler eller mellan cytomembran och DNA och främjar därmed vidhäftning. Dessutom kan det också framkalla oordnade laddningar på cytomembranytan, förändra membranpermeabiliteten och underlätta inträdet av exogena nukleinsyror i cellerna.

PEG är ett viktigt medel som förbättrar omvandlingseffektiviteten. Låg omvandlingseffektivitet kan i de flesta fall förbättras genom att tillsätta mer PEG. Under normala förhållanden är prestandan hos PEG med låg molekylvikt (t.ex. PEG3000) överlägsen den hos PEG med hög molekylvikt (t.ex. PEG8000). Detta måste dock optimeras för olika arter .

Transformationseffektiviteten påverkas också av temperaturen. Generellt sett bör DNA- och protoplastblandningen placeras på is i 15-30 minuter, så att DNA:t kan fästa på protoplasternas yta .

Regenerering av protoplaster

För att garantera en god återhämtning av livskraftiga protoplaster tillåts protoplasterna återhämta sig på plattan utan selektionstryck under en viss tid innan de överförs till en selektiv platta. En osmotisk stabilisator bör ingå i regenereringsodlingen. Ett stabilt osmotiskt tryck är en nyckelfaktor för att protoplasten ska kunna regenerera cellväggen. Endast de protoplaster som bär exogena nukleinsyror kan växa på det selektiva mediet.

Kommentarer till PMT-metoden

Protoplasttransformationsmetoden är enkel och effektiv utan behov av dyr utrustning. Men protokollet omfattar många steg och kritiska reagenser. Varje steg måste optimeras och reagensernas kvalitet måste testas kritiskt. Tillväxtstatusen hos de svampar som transformeras måste övervakas noggrant. Erfarenhet är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av denna metod.

Agrobacterium -medierad transformation (AMT)

Agrobacterium är en gramnegativ bakterie som vanligen förekommer i jord. Agrobacterium tumefaciens kan infektera skadade växter. Den tumörinducerande plasmiden på > 200 kb, som också kallas Ti-plasmid, kunde isoleras i det tidiga skedet av infektionen. När A. tumefaciens infekterar en växt kommer den in i växten genom såret och integrerar en del av Ti-plasmidan i arvsmassan i de infekterade växtcellerna. Det integrerade DNA-fragmentet från Ti-plasmidan kallas vanligen för överförings-DNA eller T-DNA. T-DNA:t infogas i växtgenomet slumpmässigt som monoklon. T-DNA flankeras av två riktningsmässiga imperfekta upprepningar (kallade vänster och höger kant) och innehåller gener som kodar för enzymer som är ansvariga för bildandet av växthormoner, som orsakar tumörtillväxt . En binär vektor utformades för att ha målgenen infogad mellan de vänstra och högra T-DNA-gränserna, och den rekombinanta plasmiden transformerades till Agrobacterium tumefaciens. Den positiva Agrobacteriumklonen användes som ett medel för att integrera målgenen i svampens arvsmassa. De specifika stegen kommer att diskuteras i detalj nedan.

AMT-metoden har visat sig vara stabilare och effektivare än konventionella transformationsmetoder sedan den första artikeln rapporterade att denna metod kunde tillämpas på svamptransformation. AMT-metoden tillämpades först för att transformera S. cerevisiae . En plasmid med en gen för hygromycinresistens används vanligen för att transformera Aspergillus awamori . AMT-metoden har tillämpats på många Ascomyceter, inklusive Aspergillus , och Monascus purpureus . De grundläggande stegen i AMT-metoden visas i figur 2. En sammanfattning av Agrobacterium-medierade transformationsprotokoll för olika svamparter finns i tabell 3.

De grundläggande stegen i Agrobacterium-medierad transformation

Faktorer som påverkar AMT-effektiviteten

Många faktorer påverkar AMT-effektiviteten, bland annat typen av svampmaterial (protoplast, sporer, hyfer och fruktkroppsvävnad), koncentrationen av acetosyringonet, förhållandet mellan svamp och Agrobacterium och villkoret för samodling.

1. Typ av utgångssvampmaterial AMT-metoden kan använda protoplaster, sporer, hyfer och fruktkroppsvävnad från svampar som mottagare. Lämpliga utgångsmaterial bör väljas för olika stammar. AMT-metoden fungerar till exempel endast för protoplaster av Rhizopus. oryzae och Mucor circinelloides, medan sporer eller groddsporer inte skulle ge transformanter .

2. Koncentrationen av acetosyringon (AS) AS verkar i två steg under AMT-processen. Den ena är induktionsprocessen och den andra är transformationsprocessen. AS används i allmänhet för att inducera uttrycket av Vir-domänen av T-DNA, och genen i Vir-domänen aktiverar överföringen av T-DNA. Ett flertal studier har visat att en lämplig mängd AS var nödvändig under omvandlingsprocessen. Det är dock inte absolut nödvändigt att tillsätta AS under Agrobacteriums förkultiveringsstadium, vilket skulle kunna minska transformationseffektiviteten för vissa stammar. Koncentrationen av AS är en viktig faktor som påverkar omvandlingseffektiviteten under samodlingsprocessen svamp-Agrobacterium i AMT av Aspergillus awamori .

3. Förhållandet mellan svampar och Agrobacterium Inom vissa gränser kommer omvandlingseffektiviteten att nå sin maximala nivå med ökningen av mängden svamp eller Agrobacterium. Ett optimalt förhållande för AMT för olika svampar måste bestämmas empiriskt. Förhållandet mellan svamp- och bakterieceller bör optimeras för olika transformationssystem för svamp och Agrobacterium.

4. Förutsättningarna för samodling Förutsättningarna för samodling är en viktig faktor i AMT-metoden. Detta inkluderar odlingstid, temperatur, pH och val av filter. Temperaturen och tiden för samodling är de viktigaste faktorerna bland AMT-stegen. Vid transformationen svamp-Agrobacterium är ett lämpligt startvillkor en temperatur på 20-28 °C och en samodlingstid på 16-96 timmar. En lägre temperatur (20-25 °C) är vanligtvis fördelaktig för AMT-metoden. Filtret, som är hydrofilt och tjänar som stöd för samodling av svamp-Agrobacterium, underlättar överföringen av enskilda kolonier till screeningplattan. Ett nitrocellulosemembran, nylonmembran, filterpapper, cellofan och polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran kan användas som filter .

Kommentarer till Agrobacterium-medierad omvandling

AMT-metoden öppnar en ny väg för de svampar som är motsträviga till omvandling med konventionella metoder. AMT-metoden är särskilt lämplig för att generera knock-in mutationer hos svampar eftersom T-DNA slumpmässigt infogas i genomet som en enda kopia. Dessutom kan AMT uppnå hög homolog rekombinationseffektivitet i olika genmålningsexperiment .

De viktigaste fördelarna med AMT-metoden är för det första diversifierade transformationsmottagare, inklusive protoplaster, hyfer och sporer, för det andra förmågan att integrera exogena gener i genomet för att bilda stabila transformanter, och för det tredje hög transformationseffektivitet som resulterar i ett stort antal transformanter .

Amt-metoden kräver binära vektorer, som är tråkiga att förbereda. Flera faktorer måste beaktas vid optimering av transformationsprocessen. Detta är en stor begränsning av AMT-metoden .

Elektroporationstransformation

Elektroporation är en enkel, snabb och effektiv transformationsmetod för filamentösa svampar. Vid elektroporation lagras elektriska laddningar i en kondensator för att bygga upp en hög spänning, provet träffas av impulsspänningen och den exogena nukleinsyran kan omedelbart överföras till cellerna. Vanligtvis används kvadratiska vågor eller exponentiella avklingningsvågor vid omvandling av svampar . Exponentiella avklingningsvågor genereras helt enkelt genom att ladda och urladdning av en kondensator. Det elektriska fältet avtar exponentiellt från toppvärdet. En fyrkantig våg är en icke-sinusoidisk periodisk vågform (som kan representeras som en oändlig summering av sinusoidiska vågor), där amplituden växlar med en jämn frekvens mellan fasta minimi- och maximivärden. Olika vågformer för elektroporation används för olika arter. En sammanfattning av vågformer som används vid elektroporation för olika arter finns i tabell 4.

När en cell utsätts för det elektriska fältet kommer cytomembranens struktur att förändras med en spänning inducerad mellan cytomembranen. Mikroporer kan bildas i cytomembranen efter en elektrisk chock. Den inducerade permeabiliteten i cellväggen är reversibel inom tröskelvärdena för spänningen och varaktigheten, annars kommer den att orsaka irreversibla skador på cellerna. Därför verkar mikroporerna i cytomembranen ha två mönster efter en elchock, det reversibla och det irreversibla mönstret. Lipid- och proteinmolekylerna i cytomembranen kan återställa den ursprungliga strukturen när en lämplig fältintensitet tillämpas, medan den irreversibla elchocken kommer att ge upphov till irreparabilitet eller extremt långsam återhämtning, vilket slutligen leder till celldöd . Exogent DNA kan överföras till bakterier, växtprotoplaster, djurceller och filamentösa svampar genom elektroporation. Denna metod har framgångsrikt tillämpats på flera svampar. Ozeki et al. upptäckte att groddsporer är mer mottagliga för omvandling genom elektroporation . På senare år har elektroporation blivit en tillförlitlig metod för genomvandling av vissa vanliga stammar . En sammanfattning av elektroporationsmedierade omvandlingsprotokoll för olika svamparter finns i tabell 5.

Faktorer som påverkar elektroporationsomvandling

Elektroporationsparametrar

1. Elektrofältsintensitet Elektrisk fältintensitet Elektrisk fältintensitet är den viktigaste faktorn som påverkar elektroporationseffektiviteten. När den applicerade elektriska fältintensiteten når storleken kV/cm och pulsbredden μs-ms-skalan kommer cytomembranen att förändras och många mikroporer kommer att genereras på cellväggarna . En hög intensitet i det elektriska fältet är förknippad med ett högt upptag av exogena nukleinsyror och lägre cellöverlevnad. Olika typer av celler kräver dock olika elektriska fältintensiteter på grund av skillnader i cytomembranens komponenter . Få mikroporer bildas när intensiteten i det elektriska fältet inte överskrider den erforderliga tröskeln. Tvärtom leder en för hög intensitet i det elektriska fältet till irreversibla skador på cytomembranen, vilket leder till celldöd.

2. Kapacitans Under elektroporationsprocessen beror variationen i elektriska laddningar och intensiteten i det elektriska fältet som appliceras på cellsuspensionen på kapacitansen och pulslängden. Impulsenas intensitet och varaktighet påverkas också av kapacitansen, varför större kapacitans ger bättre omvandlingseffekter .

3. Pulsvaraktighet och frekvens Perforationens varaktighet på cytomembranen, som är direkt relaterad till elektroporationens omvandlingseffektivitet, påverkas av pulsvaraktighet och frekvens .

Elektroporationsmiljö och externa faktorer

1. Buffertlösning Buffertlösningen utgör en viktig miljö för elektroporation av celler, och pH-värdet i elektrochockbuffertlösningen är av stor betydelse. Normalt används en buffert med pH 7,0. Celler punkteras och dödas lätt vid pH högre än 7,0 .

2. Temperatur En stor mängd värme produceras under elektroporationsprocessen, som avges till buffertlösningen. Därför rekommenderas en sänkt temperatur (0-4 °C) för bättre effekt . Dessutom kan isbadning av blandningen före elchocksbehandlingen också förbättra elchockseffekten.

3. Koncentration av exogen nukleinsyra Generellt sett ökar elektroporationseffektiviteten med koncentrationen av exogen nukleinsyra. Kompakt superhelix-DNA kommer lättare in i cellerna genom cytomembranen. År 1995 rapporterade en studie att varje 1 μg plasmid-DNA kunde generera 100 transformanter för A. niger .

Kommentarer om elektroporationsmetoden

Elektroporationsmetoden har tillämpats i stor utsträckning på många olika typer av celler, inklusive prokaryoter och eukaryoter. Denna teknik har potential att bli den bästa metoden för omvandling av outforskade svamparter. Jämfört med PMT-metoden, där komplicerade steg ingår, är elektroporation enkel och bekvämare. Elektroporationens mekanism är dock fortfarande oklar. Perforeringshastigheten för cytomembranen är beroende av många parametrar för det elektriska fältet. Och dessutom krävs lämpliga buffertförhållanden för att den ska vara optimalt effektiv.

Biolistisk omvandling

Biolistisk omvandling kallas också för partikelbombardemang. Principen är att främmande DNA adsorberas på ytan av volfram- eller guldpartiklar. Under tryck av högt tryck injiceras partiklarna i värdcellerna. Partikelbombardemang kan realisera både stabil och övergående omvandling.

Flera faktorer påverkar effektiviteten av bombardemang i mönster av komplexa interaktioner . Biologiska parametrar (celltyp, tillväxtförhållanden och celltäthet) och instrumentella inställningar (partikeltyp och partikelstorlek, vakuum- och trycknivå, målavstånd) är viktiga variabler .

Partikelbombardemang är den mest kraftfulla av alla metoder för genetisk omvandling. Den är inte föremål för begränsningar av celltyper av värd eller arter. För svampar är partikelbombardemanget tillräckligt effektivt för de organismer som är svåra att odla eller från vilka protoplaster är svåra att förbereda. Partikelbombardemanget är enkelt och bekvämt att använda. Instrument och förbrukningsmaterial för partikelbombning är dock dyra. Det kommer endast att övervägas i de fall då andra metoder inte fungerar. För närvarande har partikelbombardemang använts för att framgångsrikt omvandla A. nidulans och T. reesei , etc.

Shock-wave-medierad omvandling (SWMT)

SWMT utnyttjar principen om energiomvandling och -överföring för att generera övergående tryckstörningar och vridningskrafter över cellerna för att bilda övergående kavitationseffekter . Denna metod har tillämpats inom medicinsk behandling som ortopedi och krossning av njursten . SWMT förändrar cellmembranens permeabilitet genom akustisk kavitation, vilket leder till att exogen nukleinsyra tas upp i cellerna. Metoden har framgångsrikt använts för att föra in exogen nukleinsyra i Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa och Salmonella typhimurium . År 2013 rapporterade Denis Magaña-Ortíz et al. för första gången om tillämpningen av SWMT för svampar, inklusive A. niger, Fusarium oxysporum och Phanerochaete chrysosporium . I denna artikel noterades tre fördelar med SWMT-metoden. För det första kan denna metod, jämfört med konventionella transformationsmetoder, direkt verka på sporer men inte på protoplaster. För det andra var de fysiska parametrarna lätt att kontrollera, endast antalet sporer, chockvågens energi och hastighet behövde kontrolleras exakt. För det tredje var omvandlingseffektiviteten utmärkt. Resultaten från Denis Magaña-Ortíz et al. visade att jämfört med Agrobacterium-transformationsmetoden kunde SWMT-metoden öka transformationseffektiviteten med 5400 gånger för A. niger .

Men vissa begränsningar i denna transformationsmetod var också anmärkningsvärda. Eftersom en stor del av DNA skadas vid stötvågsbehandlingen var omvandlingseffektiviteten, som bestäms av förhållandet mellan DNA och celler, ganska låg . För det antal celler som berörs var omvandlingseffektiviteten dock betydligt högre . När man utvärderar effektiviteten måste man ta hänsyn till två aspekter: mängden DNA och antalet celler. I det experiment som utfördes av Magana-Ortiz et al. är plasmid-DNA som används vid protoplasttransformation och elektroporation i allmänhet cirka 1-10 μg . Det är dyrt och besvärligt att producera en sådan stor mängd plasmid i laboratoriet för SWMT-metoden. Dessutom är chockvågskällor och instrument dyra eftersom de i första hand är utformade för medicinska ändamål. Detta visar sig vara ett stort hinder för att införa denna metod i ett mikrobiologiskt laboratorium med begränsade resurser.