Resultat och diskussion

Vår nya AMHS-metod underlättas av den anatomiska/funktionella strukturen hos binas cirkulationssystem. Cirkulationen framtvingas av pulserande kontraktion av de dorsala och ventrala membranen, som pumpar hemolymphe in i hjärtat. Därefter transporterar aortan hemolymfen in i huvudet (fig. 1F), som förser binas hjärna och antenner med hemolymfen.

Vid jämförelse med TCHS gjorde AMHS det möjligt att samla in 80-100 μl steril hemolymfen på kortare tid och från ett mindre antal individer, vilket minimerade risken för melanisering. Vi anser att det vid insamling av hemolymphe är viktigt att minimera tiden för dess kontakt med luft. Risken för melanisering minskar med en kortare insamlingstid och snabbare övergång till kylningssteget. Förutom den förkortade insamlingstiden är den minskade användningen av insekter en annan väsentlig fördel med AMHS jämfört med TCHS. Apidaeforskning bör alltid utformas så att antalet bin som måste skadas minimeras. Användningen av AMHS för att minska antalet bin som behövs för att samla in en erforderlig hemolymfvolym är förenlig med de vägledande principerna för en mer etisk användning av djur inom forskningen .

Våra nuvarande resultat visade också att en större insektsstorlek var förknippad med en enklare och snabbare hemolymfprovtagning och med större volymer av insamlad hemolymf (tabell 1). Hemolymphprovtagning från Apis mellifera carnica och Apis cerana arbetare tog längre tid och krävde fler insekter än hemolymphprovtagning från humlor, eftersom de förstnämnda arterna är betydligt mindre och har mindre hemolymph.

Hemolymph samlas oftast in med kapillärer med hjälp av varierande metoder, till exempel genom att punktera hjärtat, den dorsala eller ventrala thoraxsinus eller den dorsala aorta . Var och en av dessa metoder innebär en risk för att ventrikeln punkteras, vilket leder till att provet kontamineras med tarminnehåll. En sådan kontaminering gör inte bara provet oanvändbart utan kräver också att kapillären måste bytas ut mot en ny eller rengöras och desinficeras före nästa användning – vilket ökar den totala tiden för insamling av hemolymphe. Hemolymphs sterilitet kan också äventyras genom att man punkterar det membran som förbinder buksegmenten. Användning av AMHS eliminerar dessa kapillärrelaterade problem. Dessutom kan insamling av hemolymphe genom halshuggning förorena hemolymphen med nektar som läcker från binas mage. Vårt nya AMHS-system resulterade i hemolymphprover av hög biologisk kvalitet. Hemocyter var tydligt synliga i varje hemolymphprov som samlades in med AMHS (fig. 1C). Analysen av varje mikroskopglas visade att de hemolymphprover som erhållits med AMHS var rena och genomskinliga, utan kontaminering (t.ex. pollenkorn).

Vi förväntade oss att när AMHS används skulle etanoldesinfektion och begränsad kontakt mellan hemolymphdroppen och biets kropp säkerställa sterilitet i provet. Denna förväntan bekräftades genom mikrobiologiska tester. Inkubering av hemolymf som erhållits genom AMHS på både MRS och Sabouraud agarmedium bekräftade hemolymfens sterilitet. Ingen mikroorganismtillväxt observerades på någon av de 100 dropparna av hemolymphe som pläterades. Därför presenteras inga kvantitativa resultat här. Efter avslutad inkubationsperiod observerade vi endast mörkbruna cirklar av melaniserad hemolymphe runt varje droppe. Denna melanisering inträffade under inkubationsperioden, inte under provtagningen (fig. 1D och 1E). Noterbart är att när den insamlade hemolymphen inte ska användas för mikrobiologiska tester kan desinfektionssteget utelämnas. Det är möjligt att etanol som appliceras på antennområdet kan påverka enzym- eller hormonaktiviteter.

Andra faktorer än metodik kan påverka effektiviteten i insamlingen av hemolymphe. I våra tidigare studier observerade vi att mängden hemolymphe som samlas in från ett bi inte bara beror på biets kast och ålder utan också på dess grad av hydrering mätt utifrån volymen nektar eller sockersirap som konsumerats före hemolympheprovtagningen. Ptaszyńska et al. rapporterar att det är mindre effektivt att ta prover av rätt volymer hemolymphe från äldre bin. Dessutom kan effektiviteten i provtagningen bero på forskarens laboratoriekompetens. Dessa faktorer gör det svårt att jämföra de kvantitativa egenskaperna hos olika protokoll för provtagning av hemolymphe mellan studier som utförts i olika laboratorier och med olika organismer. I våra tidigare undersökningar har vi tagit prover på hemolymphe från tusentals bin med AMHS och andra metoder, inklusive TCHS . Vår laboratoriepersonal har stor erfarenhet av att samla in hemolymphe från bin av olika åldrar och kast. Denna erfarenhet hjälpte oss att jämföra de olika provtagningsmetoderna, eftersom våra resultat inte påverkades av fel som berodde på laboratoriepersonalens varierande kunskaper. Våra nuvarande resultat visade att AMHS var en effektiv, ren och mycket noggrann metod (tabell 1) som var mindre tidskrävande än TCHS .

Hemolymphprovtagning med hjälp av andra metoder än AMHS kräver vanligtvis ytterligare utrustning, t.ex. mikrokapillärrör. Dessutom kräver avlägsnandet av hemolymphe från mikrokapillärrör antingen användning av en särskild pump eller att rören krossas och centrifugeras med pärlor. En annan fördel med AMHS är möjligheten att använda en pipettskala för att mäta volymen hemolymphe som samlats in från ett enskilt bi. Detta är särskilt användbart vid biokemiska analyser av mikroprover, t.ex. för att bestämma enzymaktiviteter . Det är värt att notera att när man tillämpar andra metoder än AMHS kan man indirekt beräkna volymen ren hemolymphe, baserat på volymen av hemolymphtunnan i ett rör före provtagning och den uppmätta volymen av hemolymphtunnan efter provtagning. En sådan metod kan dock leda till ytterligare fel, och därför använder vissa forskare Hamiltons sprutor . AMHS undviker den kostnad och det extra arbete (t.ex. avproppning av sprutor, desinficering osv.) som användningen av Hamiltonsprutor innebär.

Mayack och Naug-metoden (hemolymphe samlas in genom att snurra bin med avklippta antenner) liknar AMHS-metoden. Deras metod kräver dock både en laboratoriecentrifug, och apornas munstycken var tvungna att limmas ihop för att förhindra eventuell kontaminering. I deras studie dissekerade de dessutom apornas inälvor för att bedöma Nosema ceranae-infektion innan bina snurrades. Utan detta steg skulle inälvorna vara en trolig källa till kontaminering. Deras metod innebar att man placerade bina i centrifugeringsrör och snurrade dem vid 16 000 RCF i 30 sekunder för att få fram hemolymphe. Denna process kan stratifiera hemolymphkomponenterna (t.ex. proteiner och hemocyter) och medför ökade risker för mikrobiologisk kontaminering och melanisering av hemolymphen (se diskussionen ovan). Även om det kan vara idealiskt för att analysera hemolymfens sockernivåer bland honungsbina som söker efter bin med tidigare borttagna tarmar (som i deras studie), är det inte helt lämpligt för mikrobiologiska och genetiska studier eller undersökningar av enzymaktiviteter. I detta sammanhang är vår nya AMHS-metod mer lämplig för allmän användning, eftersom den är lätt och enkel och sannolikt kan användas i ett stort antal olika typer av studier.