Belysningen på jordytan varierar med >10 storleksordningar under den normala dag-natt-cykeln, och ryggradsdjurens visuella system täcker hela detta intervall av ljusintensiteter med två neuronala delsystem som är beroende av aktiviteten hos två typer av fotoreceptorceller, stavar och tappar. Människans stavseende fungerar över ungefär sju decimalnivåer av belysningsstyrka. Det visuella systemet med kottar fungerar över ett ännu större område (Rodieck 1998). Ljusanpassning sker på alla nivåer i det visuella systemet, från fotoreceptorer till centrala neuroner. Ändå är hela det visuella systemets funktion beroende av själva fotoreceptorernas förmåga att anpassa sin känslighet till den omgivande belysningssituationen. Fotoreceptorerna måste alltså generera tillförlitliga signaler på natten när enstaka fotoner fångas upp mellan långa intervall av mörker, och de måste också fortsätta att ge signaler vid de mycket höga ljusintensiteter som förekommer under en solig dag. Fotoreceptorernas ljusanpassning förmedlas sannolikt av flera och kanske redundanta molekylära mekanismer (Detwiler och Gray-Keller 1992; Lagnado och Baylor 1992; Bownds och Arshavsky 1995; Pugh et al. 1999). Nyligen sammanfattade Pugh et al. 1999 nio enskilda molekylära mekanismer som tros vara inblandade i anpassningen och diskuterade deras relativa bidrag till hela anpassningsprocessen. En studie av samma författare, som publiceras på sidan 795 (Nikonov et al. 2000, detta nummer), ger experimentellt stöd för deras insikter och vidareutvecklar en teoretisk ram som kommer att påverka framtida studier av fotoreceptorers ljusanpassning.
De molekylära mekanismer som ligger till grund för ljusanpassning kan diskuteras i samband med de reaktioner som styr cGMP i fotoreceptorns cytoplasma (Hodgkin och Nunn 1988):
Den intracellulära koncentrationen av cGMP bestäms av hastigheten för dess syntes av guanylylcyklaset och hastigheten för dess hydrolys av cGMP-fosfodiesteraset (PDE). Denna koncentration övervakas ständigt av de cGMP-styrda kanalerna som finns i fotoreceptorns plasmamembran. I den mörkeranpassade fotoreceptorn bibehålls en stabil cGMP-koncentration på några mikromolars. Detta håller en del av de cGMP-styrda katjoniska kanalerna i det yttre plasmamembranet öppna och cellen depolariserad. Ljuset får cGMP att sjunka genom att aktivera PDE via den enzymatiska kaskad som omfattar fotoaktiverat rhodopsin, det G-protein som kallas transducin och effektorenzymet PDE. Minskningen av cGMP-koncentrationen leder till kanalstängning och hyperpolarisering av fotoreceptorn. Återhämtning av ljusreaktionen sker när den excitatoriska kaskaden inaktiveras, cGMP-nivån återställs av guanylylcyklas och kanalerna öppnas på nytt. Under fotoreaktionen sjunker också den intracellulära Ca2+-koncentrationen eftersom dess inträde genom de cGMP-styrda kanalerna blockeras medan det fortsätter att extruderas av en Na2+/Ca2+-K+, utbytesmolekyl som finns i plasmamembranet. Det är denna Ca2+ -nedgång som har pekats ut som den viktigaste faktorn bakom ljusanpassning eftersom den leder till återkopplingsreglering av olika komponenter i fototransduktionskaskaden.
För att illustrera vikten av ljusanpassning för normal fotoreceptorfunktion kan man tänka på följande. För att stavfotoreceptorer ska kunna registrera minimala ljusstimuli måste en hög grad av signalförstärkning uppnås i rhodopsin-transducin-PDE-kaskaden. Till exempel, vid toppen av paddans stavsvar på en enda foton, som inträffar ∼1 s efter fotonabsorptionen, blir ∼5 % av de öppna, ljuskänsliga kanalerna stängda. Detta innebär att en stadig belysning med endast ∼100 fotoner per sekund skulle stänga alla kanaler och göra cellen okänslig för ytterligare ljusstimulering. Men eftersom stavarna anpassar sig till ljuset undviks denna mättnad tills den omgivande belysningen ger en fotonintagshastighet på ∼10 000 fotoner per sekund. Anpassningseffekten är ännu mer djupgående hos tappar: de mättas praktiskt taget aldrig.
Övergången mellan fotoreceptorns mörker- och ljusanpassade tillstånd åtföljs av två betydande förändringar i fotoreceptorernas fysiologiska egenskaper. För det första är ljusanpassade fotoreceptorer mindre ljuskänsliga, vilket förhindrar att de blir blinda vid höga ljusintensitetsnivåer. För det andra producerar ljusanpassade fotoreceptorer snabbare fotoreaktioner, vilket förbättrar den tidsmässiga upplösningen i det visuella systemet. Det är på dessa två egenskaper som termen ”ljusanpassning” oftast har tillämpats, och den rådande uppfattningen i litteraturen tyder på att Ca2+-återkopplingssystemen ligger till grund för båda. Ett oerhört viktigt bidrag från Nikonov et al. 2000 är att utmana detta synsätt. Författarna undersökte ljusanpassningsprocessen i salamanders stavfotoreceptorer och ger experimentella bevis för att både fotoreceptorernas desensibilisering och acceleration av responsen i stort sett är oberoende av Ca2+-återkoppling. Istället är de ett resultat av den förhöjda PDE-aktivitet som orsakas av stadig bakgrundsbelysning.
En effekt av stadig PDE-aktivering på den absoluta responskänsligheten är ganska okomplicerad. Eftersom svarets absoluta känslighet är proportionell mot det absoluta antalet kanaler som var öppna före blixten, leder minskningen av antalet öppna kanaler som orsakas av den stadiga belysningen automatiskt till en komprimering av svarsamplituden. Kompressionen av responsen är dock en relativt liten del av den totala effekten av den stadiga PDE-aktiveringen. Huvudkällan till minskningen av flashkänsligheten beror på att signalåterhämtningen påskyndas av PDE-aktiveringen. Formellt sett uppstår denna acceleration eftersom tidskonstanten för den reaktion som styr den blixtinducerade cGMP-förändringen är omvänt proportionell mot den specifika PDE-aktiviteten per cytoplasmavolym. Denna tidskonstant är exakt samma tidskonstant som styr omsättningen av hela cytoplasmapoolen av cGMP under samma belysningsförhållanden.
Det sistnämnda konceptet är inte intuitivt, och Nikonov et al. 2000 ger en hydrodynamisk ”badkar”-analogi för att illustrera denna effekt i diskussionen av deras artikel. Vi tillhandahåller en annan analogi som kan tilltala läsaren som är bekant med egenskaperna hos elektriska kretsar. Tänk på en elektrisk krets som består av ett variabelt motstånd, en kondensator och en konstant strömkälla. Spänningen (V) över kondensatorn representerar cGMP-koncentrationen. Strömmen (i) som laddar kondensatorn (C) representerar hastigheten för cGMP-syntesen av guanylylcyklas (α, enligt Nikonov et al. 2000), medan kondensatorn representerar cellvolymen. PDE-aktiviteten representeras av det variabla motståndet (R(I)), som regleras av ljuset (I). Motståndets konduktivitet, 1/R, representerar summan av den mörka basala PDE-aktiviteten och den ljusstimulerade PDE-aktiviteten. Spänningen över kondensatorn bestäms av balansen mellan strömmen i kretsen och läckaget genom motståndet. Ekvationerna som beskriver förändringarna av spänningen i kretsen är identiska med de ekvationer som beskriver dynamiken i cGMP-koncentrationen i staven.
I denna analogi representeras en blixtreaktion av införandet av en kort, övergående minskning av R(I). Detta får spänningen att sjunka till en viss nivå, varefter den exponentiellt återgår till den stabila nivån med en tidskonstant τ = RC. Eftersom 1/RC är likvärdigt med förhållandet mellan PDE:s steady state-aktivitet och cytoplasmavolymen (β, enligt Nikonov et al. 2000), representerar RC tidskonstanten för utbytet av cytoplasmapoolen av cGMP. Då är det tydligt att en högre steady PDE-aktivitet minskar denna tidskonstant och leder till en snabbare återhämtning av cGMP till sin grundnivå. Nikonov et al. 2000 visar att denna andra kinetiska effekt av den stabila PDE-aktiviteten före blinket är den viktigaste faktorn för att påskynda fotoresponsen under ljusanpassning. Det är viktigt att notera att eftersom kretsen är linjär är tidsförloppet för återhämtningen av ”flash”-responsen oberoende av det stabila värdet av strömmen i. Förändringar i i skalar helt enkelt amplituden av spänningsresponsen (cGMP) utan att förändra dess karakteristiska återhämtningstid. Nivån på den stationära cyklasaktiviteten, i i i denna analogi, har således ingen betydelse för hur snabbt fotosvaret återhämtar sig.
Den snabbare återhämtningen innebär att blixtsvaret utvecklas under en kortare tidsperiod, och detta minskar känsligheten för en blixt överlagrad på en stationär bakgrund. Således minskar PDE-aktiveringen i steady state fotoreceptorns känslighet genom de kombinerade effekterna av att minska fraktionen av öppna kanaler och genom att förkorta fotoresponsen. Eleganta experiment gjorde det möjligt för Nikonov et al. 2000 att kvantifiera graden av PDE-aktivering vid konstant bakgrundsbelysning. De visar att av den ∼100-faldiga minskningen av blixtkänsligheten som observerades med deras ljusaste bakgrundsintensiteter (se fig. 6 i Nikonov et al. 2000) beror ∼5-faldigt på svarskompressionen och ∼15-faldigt på PDE-aktiveringens kinetiska effekt, med den resterande delen troligen beroende på effekten av recoverin som verkar på den aktiverade rhodopsinlivslängden.
När man nu har tillskrivit huvuddelen av minskningen av fotoreceptorernas känslighet och accelerationen av fotoreaktionen till den förhöjda PDE-aktiviteten före blixten uppstår frågan: Vilken roll spelar Ca2+-återkopplingen i ljusanpassningen? Svaret är tydligt när vi tänker på att den stadiga PDE-aktivitet som produceras av bakgrundsljuset orsakar en betydande ökning av den hydrolytiska cGMP-aktiviteten. Om det inte fanns några kompensationsmekanismer skulle cGMP-koncentrationen minska dramatiskt, även vid måttlig bakgrundsbelysning, vilket till slut skulle lämna inga kanaler öppna för att registrera ytterligare ljusförändringar. Den mest grundläggande rollen för Ca2+ vid ljusanpassning är således att motsätta sig denna mättnad genom att engagera ett antal molekylära mekanismer som i slutändan leder till att kanalerna öppnas på nytt och därmed till en utvidgning av det intervall av ljusintensiteter över vilket fotoreceptorn fungerar (se Pugh et al. 1999 för referenser och en detaljerad diskussion).
Den viktigaste intervallförlängande effekten av Ca2+ medieras av en återkoppling till guanylylcyklas genom Ca2+-bindande proteiner, så kallade guanylylcyklas-aktiverande proteiner. Ljusberoende Ca2+ minskning orsakar en ökning av cGMP-synteshastigheten som motverkar den förhöjda stabila PDE-aktiviteten under bakgrundsbelysning. Denna effekt av stadigt bakgrundsbelysning bör inte förväxlas med den dynamiska Ca2+-återkopplingen på guanylylcyklas under blixtsvaret som påskyndar återhämtningen av blixtsvaret. Nikonov et al. 2000 hävdar att effekten av dynamisk cyklasaktivering varierar lite med bakgrundsbelysningsförhållandena och därför inte bör betraktas som en viktig faktor vid ljusanpassning.
Den andra räckviddsförlängande effekten av Ca2+ riktar sig direkt mot de cGMP-gaterade kanalerna. Ca2+ minskning gör att kanalerna blir känsligare för cGMP, så att de fungerar vid lägre cGMP-koncentration. Denna effekt förmedlas sannolikt av calmodulin eller calmodulinliknande proteiner, och verkar vara mer betydelsefull i kottar än i stavar (Rebrik et al. 2000). Båda dessa effekter leder till att de cGMP-gaterade kanalerna öppnas på nytt under stadig belysning utan att orsaka några desensibiliserande effekter; istället resensibiliserar de fotoreceptorn.
Den tredje Ca2+-återkopplingen skiljer sig från de andra eftersom den både orsakar en räckviddsförlängning och bidrar till desensibiliseringen av cellen. Ca2+ -nedgång ökar rhodopsinfosforyleringen genom det Ca2+ -bindande proteinet recoverin, vilket leder till en minskning av livslängden hos det aktiverade rhodopsinet. Detta leder till desensibilisering eftersom det minskar antalet PDE-molekyler som aktiveras av varje rhodopsin. Verksamhetsområdet utökas också eftersom det minskade antalet aktiva PDE:er innebär en minskad stabil cGMP-hydrolyshastighet. Både Nikonov et al. och annan nyare litteratur som författarna diskuterar visar att i stavar verkar denna mekanism vara mycket mindre potent än återkopplingen på guanylylcyklaset.
Ett annat viktigt resultat som rapporteras i deras artikel är att det inte finns några indikationer på en fjärde föreslagen Ca2+-återkopplingsmekanism, nämligen den adaptiva regleringen av vinsten i kaskaden mellan rhodopsinaktivering och kanalslutningen. Lamb och Pugh 1992 utvecklade en metod för att uppskatta förstärkningen i fototransduktionskaskaden genom att analysera den inledande stigande fasen av blixtsvar. Senare visade andra undersökningar som diskuterades av Nikonov et al. 2000 att denna lutning minskade för blixtar som presenterades under bakgrundsbelysning eller medan intracellulärt Ca2+ var artificiellt reducerat i mörker, vilket ledde till slutsatsen att detta avspeglade ett Ca2+-återkopplingssystem som reducerade kaskadens förstärkning under ljusanpassning. I den aktuella artikeln visar Nikonov et al. 2000 att för bakgrundsljusintensiteter som stänger upp till 80 % av de ljuskänsliga kanalerna och resulterar i en ungefär femfaldig minskning av intracellulärt Ca2+, förändras i själva verket inte den mycket initiala stigande fasen av blixtsvar. De drar slutsatsen att den skenbara minskningen av den förstärkning som induceras av bakgrundsljus eller sänkt intracellulärt Ca2+ och som beskrivs i litteraturen sannolikt beror på den ökade stabila nivån av PDE-aktivitet och den ökade hastigheten av fotoexciterad rhodopsin-avsläckning som gör att fotosvaret lossnar från en invariant inledande bana vid mycket tidiga tidpunkter.
Nikonov och medarbetare framför nu åsikten att Ca2+-återkoppling vid ljusanpassning nästan uteslutande tjänar till att öka fotoreceptorns känslighet snarare än som en mekanism för fotoreceptorns desensibilisering. Även om detta kan låta paradoxalt var den sensibiliserande effekten av den Ca2+-återkopplingsmedierade räckviddsförlängningen uppenbar redan i de allra första publikationerna som påvisade betydelsen av ljusinducerad Ca2+-avtagande för ljusanpassning (Matthews m.fl. 1988; Nakatani och Yau 1988). I dessa studier orsakade inhibering av Ca2+-återkoppling under stadig bakgrundsbelysning en katastrofal minskning av blixtkänsligheten. Ca2+-återkoppling förhindrade till stor del känslighetsförlusten och utökade fotoreceptorns verksamhetsområde med ∼100 gånger (se figur 2 i Matthews et al. 1988). Det eleganta med artikeln från Nikonov et al. 2000 är att de hittade ett tydligt sätt att särskilja rollerna för både desensibiliserande och sensibiliserande mekanismer i den övergripande anpassningsprocessen.
Detta för oss tillbaka till definitionen av ljusanpassning i fotoreceptorer. Som vi nämnde ovan definieras anpassning vanligtvis som en kombination av celldesensibilisering och responsacceleration. Logiken hos Nikonov et al. 2000 föreslår att det är nödvändigt att omdefiniera anpassning till att omfatta tre sammanhängande fenomen: celldesensibilisering, acceleration av responsen och utvidgning av arbetsområdet. Enskilda molekylära mekanismer kan bidra till en eller flera av dessa tre egenskaper. Såsom beskrivs av Pugh och medarbetare 1999 innebär desensibilisering i stavar en ökning av den stabila cGMP-hydrolysen, signalkompression och en minskning av rhodopsinets livslängd genom Ca2+/recoverin. Acceleration av responsen innebär en ökad stadig cGMP-hydrolys och en minskning av rhodopsinlivslängden. Förlängning av räckvidden involverar tre Ca2+ -beroende processer: en ökning av cGMP-syntesen, en ökning av kanalernas cGMP-känslighet och en förkortning av det fotoaktiverade rhodopsinets livslängd.
Nikonov et al. 2000 tillhandahåller en detaljerad matematisk modell för fototransduktion och ljusanpassning av ryggradsstavar hos ryggradsdjur, som bygger på praktiskt taget alla väletablerade biokemiska mekanismer. Modellering av detta slag innehåller naturligtvis många parametrar som lämnar stort utrymme för tvetydighet vid anpassning av svaren. I denna och i en tidigare artikel har Nikonov och kollegor (Nikonov et al. 1998, Nikonov et al. 2000) emellertid experimentellt uppskattat många av de viktigaste fysiologiska och biokemiska parametrarna oberoende av varandra. Detta eliminerar nästan helt godtycklig manipulation av parametrarna och ökar robustheten hos de slutsatser som dras från modellen.
Med den kvantitativa beskrivning av fototransduktion och ljusanpassning som Nikonov et al. ger, vad är då fortfarande okänt? Vi ger följande tre exempel här. För det första, även om Nikonov et al. inte fann några bevis för reglering av fototransduktionsvinsten under deras experimentella förhållanden, återstår det att se om reglering av vinsten förekommer vid högre belysningsnivåer, på en längre tidsskala eller hos olika arter. Om så är fallet skulle det innebära att det finns ytterligare biokemiska mekanismer och molekylära komponenter som inte ingår i det nuvarande schemat för fototransduktion. För det andra vet man lite om de molekylära mekanismer som ligger till grund för ljusanpassning hos tappar. Kottar kan täcka ett större område än stavar och är praktiskt taget omöjliga att mätta med kontinuerligt bakgrundsljus. Framtida studier bör inriktas på att förstå om hela kottarnas anpassning kan förklaras av kanske effektivare stavliknande anpassningsmekanismer, eller om den kräver ytterligare unika mekanismer. För det tredje, på en högre nivå av den visuella bearbetningen, är det okänt hur anpassning av enskilda fotoreceptorer bidrar till anpassning av hela det visuella systemet. Det återstår att fastställa hur någon av de tre komponenterna i fotoreceptorernas ljusanpassning, celldesensibilisering, responsacceleration och utvidgning av känslighetsområdet, kan leda till att vår ljusanpassade syn fungerar snabbare, med bättre kontrastkänslighet och högre rumslig upplösning.