Abstract

Bakgrund. Tidig upptäckt av grampositiv bakteriemi och lämplig antimikrobiell behandling i rätt tid krävs för att minska patientdödligheten. Syftet med vår studie var att utvärdera prestandan hos Verigene Gram-positiv blododlingsanalys (BC-GP) i två speciella vårdmiljöer och fastställa den potentiella effekten av snabba blododlingstester för Gram-positiv bakteriemi inom det japanska sjukvårdssystemet. Dessutom inkluderade studien simulerade blododlingar som innehöll ett bibliotek av välkaraktäriserade meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och vancomycinresistenta enterokocker (VRE) isolat som speglar olika geografiska regioner i Japan. Metoder. Sammanlagt 347 BC-GP-analyser utfördes på kliniska och simulerade blodkulturer. BC-GP-resultaten jämfördes med de resultat som erhållits med referensmetoder för identifiering av släkte/art och påvisande av resistensgener med hjälp av molekylära metoder och MALDI-TOF MS-metodik. Resultat. För identifiering och upptäckt av resistensgener på två kliniska platser och simulerade blododlingar var den totala överensstämmelsen mellan BC-GP och referensmetoder 327/347 (94 %). Tiden för identifiering och upptäckt av antimikrobiell resistens med BC-GP var betydligt kortare jämfört med rutintestning, särskilt på kardiologisjukhuset, som inte erbjuder klinisk mikrobiologi på helger och helgdagar. Slutsats. BC-GP genererade noggrann identifiering och detektion av resistensmarkörer jämfört med rutinlaboratoriemetoder för grampositiva organismer i specialiserade kliniska miljöer som ger snabbare resultat än nuvarande rutintestning.

1. Introduktion

Gram-positiva bakterier är de mest dominerande mikroorganismerna i samband med sepsis i vårdmiljöer och den vanligaste orsaken till bakteriemi hos patienter med hematopoetisk stamcellstransplantation . Enterokockbakteriemi är förknippad med ökad risk för dödlighet hos patienter med hematopoietisk stamcellstransplantation, oavsett känslighet för vankomycin . På kardiologiska avdelningar är infektiös endokardit, infektiöst aneurysm, kateterrelaterade blodflödesinfektioner eller infektioner på operationsstället efter hjärtoperationer de vanligaste infektionerna där de vanligaste orsakande mikroorganismerna är grampositiva cocci . På båda de medicinska enheterna är tidig upptäckt av grampositiva och resistenta markörer mycket kritisk för att hantera patientvård, antibiotikaförvaltning och förhindra spridning av resistenta mikroorganismer.

Då ett tidigt ingripande med antimikrobiell terapi är förknippat med förbättrad prognos, där varje timmes fördröjning är förknippad med ökad dödlighet, är det viktigt med en snabb diagnos . Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) är ett mikroarray-system från prov till resultat för identifiering av vanliga grampositiva bakterier och viktiga resistensmarkörer direkt från positiv blododling. Även om ett antal studier tidigare har utvärderat BC-GP:s rapporteringsprestanda som sträcker sig från 92 till 99 % överensstämmelse med konventionell metodik , har en begränsning i de tidigare rapporterna varit att många av studierna har varit från USA samt länder utanför Japan med endast en publicerad rapport med begränsad omfattning i Japan .

Genematisk variation mellan bakteriella linjer som cirkulerar i olika geografiska regioner i världen kan påverka känsligheten hos molekylära analyser baserade på oligonukleotidprober för att upptäcka organismer eller resistensmarkörer. Studier i Hongkong och Belgien har rapporterat lägre BC-GP-prestanda .

Syftet med den här studien var att fastställa den potentiella effekten på patienthantering och patientresultat av BC-GP i specialiserade sjukhusmiljöer inom den japanska hälso- och sjukvårdsmiljön, som står inför ett antal utmaningar. En alltmer åldrande befolkning och den åtföljande bördan av ökande totala sjukvårdskostnader har utmanat sjukvårdsinfrastrukturen. Trots att meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) står för över 90 % av de sjukhusförvärvade infektioner som orsakas av resistenta bakterier i Japan , är outsourcing av klinisk mikrobiologisk testning eller ingen helgtäckning vanligt i många vårdinrättningar som en del av kostnadsbegränsningen. Denna artikel utgör den första omfattande utvärderingen av BC-GP i Japan för att validera dess kliniska prestanda. Den simulerade blododlingsstudien omfattar ett bibliotek med välkaraktäriserade MRSA-stammar från sjukvården (HA-MRSA), MRSA-stammar från samhället (CA-MRSA) och vancomycinresistenta enterokocker (VRE) som cirkulerar i Japan.

2. Metoder

BC-GP utvärderades på Toranomon-sjukhuset (TH) och Sakakibara Heart Institute (SHI), i enlighet med platsspecifika institutionella granskningsnämnds godkända studieprotokoll, under perioden 26 juni 2012 till 6 mars 2013. TH är ett allmänt undervisningssjukhus med 1168 bäddar och en hematologisk vårdenhet med 123 bäddar för hematopoetisk stamcellstransplantation som utför 140-160 hematopoetiska stamcellstransplantationer per år. Sjukhusets mikrobiologiska laboratorium är i drift dagligen under dagtid. SHI är ett 320-sängars undervisningssjukhus som specialiserar sig på kardiovaskulära sjukdomar med en fallvolym på över 1 500 operationer med öppet hjärta per år. Sjukhusets mikrobiologiska laboratorium drivs av ett externt kommersiellt referenslaboratorium. Mikrobiologilaboratoriet arbetar under dagskiftet på vardagar och är stängt på helger och helgdagar.

Blododododlingar utfördes på SHI med BacT/ALERT FA-flaskor och övervakning med BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrike). TH använde BACTEC Plus-flaskor och övervakning med BACTEC 9240 och FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Endast en positiv blododlingsflaska som innehöll grampositiva kokker eller baciller per patient ingick i studien. Två ml positivt blododlingsmedium förvarades vid -85C för förnyad testning.

Rutinmässig mikrobiologisk identifiering och känslighetstestning av isolat utfördes med hjälp av konventionella identifieringstester som gallolöslighet, känslighet för optochinskivan och MicroScan WalkAway-systemet (Beckman Coulter, Pasadena, CA) vid TH och Vitek 2-systemet (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrike) vid SHI. Screening av meticillinresistens med Cefoxitin utfördes i enlighet med CLSI:s riktlinjer . Ett latexagglutinationstest för påvisande av penicillinbindande protein PBP2a användes också .

BC-GP-testning utfördes på positiva blododlingar som visade grampositiva organismer enligt tillverkarens anvisningar. Kort sagt, ett välblandat 350 μl prov av blododlingsmediet pipetterades i provbrunnen på BC-GP-nukleiextraktionsbrickan, placerades på Verigene Processor SP för bearbetning och analys med Verigene Reader.

En bedömning utfördes för att fastställa skillnaden i tid mellan rapporteringen av resultat med hjälp av BC-GP och kulturbaserad identifiering och resultat av antimikrobiell känslighet för 139 positiva blododlingsbuljonger. För kulturbaserade resultat var den tid som krävdes för att generera den slutliga rapporten tiden mellan avläsningen av gramfärgningen och inmatningen av de slutliga identifierings- och känslighetsresultaten i laboratorieinformationssystemet. För BC-GP var tiden till resultat tiden mellan avläsning av gramfärgningen och inmatning av BC-GP-resultaten i laboratorieinformationssystemet.

En utmaningsuppsättning med 208 simulerade blododlingar konstruerades med hjälp av typ-, referens- och kliniska stammar från olika geografiska områden i Japan för att utvärdera BC-GP. De kliniska stammarna omfattade organismer som utgjorde utmaningar för kommersiella identifieringssystem i tidigare kliniska studier vid TH och SHI. Dessutom testades ett bibliotek med välkaraktäriserade HA-MRSA-, CA-MRSA- och VRE-stammar från Japan. Simulerade blododlingsstudier utfördes vid Miroku Medical Laboratory (Saku City, Nagano Prefecture, Japan). Tvåhundra åtta stammar justerades till en turbiditet på cirka 100 CFU/ml i steril saltlösning. Trehundra μl inokulerades i BACTEC Plus Aerobic/F-flaskor som innehöll 8 till 10 ml mänskligt helblod (blodgrupp O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) för ett slutinokulum på 30 CFU/flaska. En BACTEC Plus Anaerobic/F-flaska inokulerades också för S. pneumoniae och S. anginosus-gruppen. Varje flaska inkuberades i BACTEC-systemet tills en positiv signal genererades. Om BC-GP genererade negativa resultat testades blododlingsmediet på nytt genom 11-faldig utspädning med sterilt destillerat vatten.

Varje positivt blododlingsisolat vid de två sjukhusen förvarades i 10 % skummjölk (Difco) vid -85C. Artidentifiering bekräftades med hjälp av matrixassisterad laserdesorptionsjoniseringstid vid flygmasspektrometri (MALDI-TOF MS) (Microflex LT med Biotyper ver. 3.0; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland) för alla stammar. Om organismen inte identifierades till artnivå med MALDI-TOF MS (poängvärde < 2,0) eller identifierades som Micrococcus, Listeria, andra Staphylococcus än S. aureus, andra Streptococcus än S. pyogenes och S. agalactiae, utfördes bekräftande testning genom PCR-direkt sekvensering av 16S rDNA eller sodA vid Juntendo University eller Tokyo Women’s Medical University . Specifik PCR för att påvisa mecA hos alla stafylokocker och vanA, vanB hos alla enterokocker utfördes. De metoder som används för SCCmec-typning av samhällsförvärvade eller sjukvårdsassocierade MRSA som används för att karakterisera stammar har tidigare beskrivits .

Överensstämmelsen fastställdes i jämförelse med resultaten från referensmetoderna. Överensstämmelse förelåg om BC-GP-måldetektering överensstämde med referensmetoden på antingen genus- eller artnivå. De nittiofemprocentiga konfidensintervallen (95 % CI) och det parade -testet bestämdes med GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Resultat

I den här studien var den totala identifieringsöverensstämmelsen mellan BC-GP och referensmetoden 327/347 (94 %) för prospektiva blododlingar på två kliniska platser och simulerade blododlingar. Den kombinerade överensstämmelsen mellan PCR och BC-GP för mecA-detektion var 71/73 (97 %) för prospektiva blododlingar och simulerade blododlingar.

Den kombinerade identifieringsnoggrannheten från de båda sjukhusen var 129/139 (93 %). För monomikrobiella odlingar var identifieringsnoggrannheten 121/124 (98 %). Överensstämmelse mellan PCR och BC-GP för mecA-positivitet var 51/53 (96 %). Tabell 1 visar resultaten från TH. Totalt sett identifierades 96/104 (92 %) organismer korrekt med BC-GP till art- eller genusnivå, inklusive upptäckt av resistensgener. Som framgår av tabell 2 var den totala överensstämmelsen mellan BC-GP och referensmetoden vid SHI 33/35 (94 %) organismer.

BC-GP rapporterar närvaron av mecA endast för S. aureus och S. epidermidis. I denna studie var 72 av de 102 stafylokockstammarna antingen S. aureus eller S. epidermidis. De avvikande resultaten berodde på att S. epidermidis-organismer med mecA inte kunde påvisas i polymikrobiella kulturer som innehöll både mecA-positiva och mecA-negativa S. epidermidis-organismer. Av de 30 Staphylococcus spp. andra än S. epidermidis och S. aureus var 21 (70 %) positiva för mecA, inklusive 2 S. lugdunensis, som inte kunde rapporteras som mecA-positiva av BC-GP.

Tabell 3 visar tidsskillnaden mellan generering av BC-GP-resultat och kulturbaserad slutgiltig identifiering och resultat av antimikrobiell känslighet vid båda sjukhusen. BC-GP-resultaten fanns tillgängliga i genomsnitt 28,2-51,0 timmar före kulturbaserad slutlig identifiering och känslighetsresultat vid TH. På SHI genererade BC-GP resultat i genomsnitt 34,5 till 196,6 timmar tidigare. Vid en jämförelse av tiden till slutliga kulturbaserade identifierings- och känslighetsresultat vid TH och SHI, med undantag för S. aureus, krävde resultaten för S. epidermidis och koagulasnegativa stafylokocker andra än S. epidermidis, enterokocker och streptokocker signifikant () längre tid vid SHI (83,3, 123,6, 159,1 respektive 199,1 timmar) jämfört med TH (40,8, 53,9, 36,1 respektive 53,5 timmar).

Med hjälp av simulerade Gram-positiva blododlingar identifierade BC-GP korrekt 198/208 (95 %) av organismerna (tabell 4). Sex streptokocker (3 %) identifierades antingen felaktigt eller identifierades endast på genusnivå av BC-GP. När det gäller de fyra BC-GP-flaskorna med falskt negativa blododlingar identifierades 1 S. pyogenes korrekt och 1 S. mitis genererade en positiv Streptococcus genus/S. pneumoniae-signal efter 11-faldig utspädning av blododlingsmediet. MecA-genen upptäcktes i 20/20 (100 %) MRSA-organismer som representerar samhällsförvärvade (SCCmec typ IIa, IV och V) och sjukvårdsassocierade (SCCmec typ I, IIb, III och icke-typbar) stammar med BC-GP. BC-GP upptäckte 14/14 (100 %) vanA- och 20/20 (100 %) vanB-gener i välkaraktäriserade VRE-stammar från tidigare studier i Japan.

4. Diskussion

Den prestanda för BC-GP som observerades i vår studie liknade tidigare rapporter . Eftersom klinisk mikrobiologi är utlagd på entreprenad eller inte fungerar under lediga skift under vardagar och är stängd på helger och helgdagar på många sjukhus i Japan, har snabbdiagnostiska tester en betydande potential att påverka patientvården genom att dramatiskt förkorta tiden till identifiering av organismer och resultat för antimikrobiell känslighet.

BC-GP påvisar mecA i alla stafylokocker baserat på mätning av signalintensitet; rapporteringen är dock begränsad till S. aureus och S. epidermidis baserat på en algoritm där mecA endast rapporteras när S. aureus eller S. epidermidis påvisas av BC-GP. I framtida versioner av BC-GP bör man överväga att ändra algoritmen för att möjliggöra rapportering av mecA-detektion för andra stafylokocker än S. aureus eller S. epidermidis, eftersom 70 % av de 30 stammarna från andra bakterier än S. aureus och S. epidermidis i vår studie var meticillinresistenta. Även om S. epidermidis är den viktigaste koagulasnegativa stafylokockpatogenen är andra stafylokocker som S. lugdunensis och S. haemolyticus viktiga patogener i vårdmiljön.

Polymikrobiellt positiva blododlingar stod för majoriteten av diskrepansen. Däremot var BC-GP:s prestanda 121/124 (98 %) i monomikrobiella kliniska blododlingar och 198/208 (95 %) i simulerade blododlingar. I denna studie stod polymikrobiella blododlingar för 14/106 (13 %) respektive 3/33 (9 %) av de positiva blododlingarna vid TH och SH. Tillsammans utgjorde polymikrobiella kulturer 17/139 (12 %) av de prospektiva kliniska blodkulturerna, vilket stämmer överens med tidigare studier som rapporterar att 6-20 % av alla blodströmsinfektioner är polymikrobiella. BC-GP identifierade korrekt alla organismer i 12/17 (70 %) av de polymikrobiella odlingarna. I tidigare BC-GP-studier varierade den korrekta identifieringsgraden i polymikrobiella kulturer mellan 57 och 86 %. Eftersom vilseledande information kan påverka den kliniska diagnosen och resultera i ett olämpligt val av antimikrobiella medel, finns det ett behov av att förstå BC-GP:s begränsningar.

Ett ytterligare problem med polymikrobiella kulturer är den kliniska tolkningen av mecA-detektion och stafylokock-detektion. I våra 17-polymikrobiella kulturer gav 5 prover 2 eller 3 stafylokockstammar med eller utan mecA. Detta kan leda till onödig användning av vankomycin eller underskattning av infektion orsakad av meticillinresistenta stafylokocker. Att upprepa BC-GP på en annan uppsättning blododlingar kan minska risken för detta problem. För monomikrobiella kulturer eller simulerade kulturer observerades alla avvikelser med streptokocker utom för en S. caprae-stam. BC-GP:s felidentifiering av streptokocker omfattade 2 S. mitis som identifierades som S. pneumoniae, ingen upptäckt av 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group och 2 S. pyogenes. I tidigare rapporter har liknande resultat också rapporterats för S. mitis, S. oralis och S. pneumoniae. Eftersom den genetiska släktskapen mellan S. mitis, S. oralis och S. pneumoniae är välkänd på grundval av >99% homologi mellan 16S rRNA-gensekvenserna , bör BC-GP-resultat för S. pneumoniae eller Streptococcus med alfahemolys utan några positiva artspecifika signaler tolkas noggrant och bekräftas med konventionella metoder, t.ex. optokinkänslighet eller gallolöslighetstest. Intressant nog kan 11-faldig utspädning av det ursprungliga blododlingsmediet leda till att Streptococcus-signalen och species-signalen upptäcks (tabell 4). Ett intervall av detektion beroende på organismen med BC-GP har rapporterats.

Den största fördelen med att använda BC-GP är den tidigare tidpunkten för rapportering av identifiering och resistensbestämningar från positiva blododlingar, vilket gör det möjligt att tidigare välja lämplig antimikrobiell terapi och genomföra smittskyddsåtgärder som isolering och försiktighetsåtgärder vid kontakt. Detta har potential att få en betydande inverkan på det japanska hälso- och sjukvårdssystemet. Skillnaden i tid mellan BC-GP-resultat och slutliga kulturbaserade identifierings- och känslighetsresultat som visas i tabell 3 vid TH överensstämmer med tidigare rapporter . Å andra sidan återspeglar de tidigare resultaten på 80,7 till 196,6 timmar för andra organismer än S. aureus med hjälp av BC-GP vid SHI att de kliniska mikrobiologiska tjänsterna inte är tillgängliga under helger och helgdagar. Eftersom klinisk mikrobiologi läggs ut på entreprenad på många sjukhus i Japan eller begränsas till ett skift under vardagar eller inte erbjuds under helger, är de potentiella kostnadsfördelarna med att behålla blododlingstjänster på sjukhusen betydande. Om laboratoriepersonalen på det allmänna laboratoriet utbildas i att känna igen grampositiva kokter och baciller kan BC-GP-testning utföras under helgen samt kvällar och nätter. BC-GP ger sjukhusen möjlighet att behålla en mycket viktig laboratorietjänst internt.

Slutsatsen är att BC-GP gav noggrann identifiering och upptäckt av resistensmarkörer jämfört med rutinmässiga odlingsbaserade laboratoriemetoder för grampositiva organismer inklusive CA-MRSA, HA-MRSA och VRE-stammar som cirkulerar i Japan. Att minimera tiden för optimering av antimikrobiell behandling med hjälp av BC-GP kan bidra till minskade kostnader och förbättrad patientvård. År 2016 fick BC-GP myndighetsgodkännande i Japan och blev det första molekylära multitarget-testet för positiva blododlingar som godkändes som en in vitro-diagnostisk enhet för att underlätta diagnosen av bakteriella blodströmsinfektioner. Ytterligare studier kommer att vara nödvändiga för att validera BC-GP:s kostnadseffektivitet inom ramen för det japanska sjukvårdssystemet.

Etiskt godkännande

Denna studie godkändes av TH:s och SHI:s interna granskningsnämnder.

Kompletterande intressen

Alla författare förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Författarnas bidrag

Ken Kikuchi utformade och genomförde studien och utarbetade manuskriptet. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa och Reiko Yabusaki utförde laboratoriearbetet. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka och Akiko Yoneyama övervakade datainsamlingen och samordnade och deltog i utformningen av studien.

Acknowledgments

Denna studie stöddes delvis av ett Grant-in-Aid (S0991013) från Japans ministerium för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), för Foundation of Strategic Research Projects in Private Universities.