Abstract

Urinvägsinfektioner (UTI) är ett globalt problem. Den mesta UTI-forskningen fokuserar på gramnegativ etiologi. Enterobacteriaceae visade sig vara den vanligaste UTI-infektionen som utgör mer än 80 % av alla rapporterade fall. De vanligaste grampositiva bakterierna i UTI-fall är Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis och Streptococcus agalactiae. Grampositiva patogener rapporterades i flera länder i både okomplicerade och komplicerade UTI-fall. Antibiotikabehandling av grampositiva bakterier är helt annorlunda än antibiotikabehandling av gramnegativa UTI-patogener. Symtomen i samband med UTI orsakade av grampositiva och gramnegativa är dock mycket likartade. Utan korrekt diagnos är risken stor att man får fel diagnos och efterföljande antibiotikabehandling. Det finns mycket begränsade studier som fokuserar på etiologi och deras antibiotikakänslighet i Bangladesh. Vårt syfte var att söka inom detta bristfälliga forskningsområde. I denna studie upptäcktes 8,2 % grampositiva bakterier hos UTI-patienter. Prevalensen visar harmoni med tidigare publicerade rapporter. Män och kvinnor visade sig vara lika infekterade av grampositiva UTI-patogener. De flesta tidigare publikationer visar att kvinnor är mer sårbara för gramnegativa UTI-bakterier. Det är osannolikt att våra resultat visar att män är lika sårbara för grampositiva bakterier som kvinnor. Ytterligare studier med fler urvalsstorlekar kan styrka de preliminära resultaten. Antibiogramanalyser visade att amikacin och gentamicin var de mest effektiva antibiotika mot våra testade isolat. Nitrofurantoin visade sig däremot vara det mest ineffektiva läkemedlet i denna studie. Resultaten av studien kan hjälpa till att förskriva antibiotika utifrån denna evidensbaserade studie.

Nyckelord

uropatogen, UTI, antimikrobiell resistens, empirisk behandling, Bangladesh

Abkortningar

API: Analytic Profile Index; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute; CLED: Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar; MDR: Multi Drug Resistant; MHA: Muller Hinton Agar; PBS: UTI: Urinvägsinfektion

Introduktion

Urinvägsinfektion (UTI) är en av de vanligaste infektionssjukdomarna. De viktigaste orsakerna till urinvägsinfektioner är Escherichia coli och andra Enterobacteriaceae. De återstående andelarna är associerade med en mängd olika organismer, inklusive de grampositiva bakterierna Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae (grupp B-streptokocker, GBS) och andra mindre ofta isolerade organismer . De vanligaste grampositiva uropatogena bakterierna är Staphylococcus saprophyticus och Enterococcus facalis . Grampositiva uropatogener rapporterades i flera länder vid både okomplicerade och komplicerade urinvägsinfektioner . Det har inte gjorts några sådana exklusiva studier på befolkningen i Bangladesh för att söka efter etiologi för grampositiva urinvägsinfektioner. Utan en korrekt diagnos är risken stor att man får felaktiga och olämpliga mediciner och att man därefter drabbas av negativa biverkningar av den tillhörande behandlingen. Grampositiva bakterier förekommer oftare som etiologiskt agens för urinvägsinfektioner hos gravida kvinnor och äldre. Vidare förekommer komplicerade urinvägsinfektioner ofta i nosokomiala och/eller institutionella miljöer och dessa personer löper större risk att drabbas av grampositiva och polymikrobiella urinvägsinfektioner . Det står för en stor del av antibiotikaförbrukningen och har en stor socioekonomisk inverkan och kan bidra till bakteriell resistens . Kliniker har ofta problem med att välja lämplig antibiotika för empirisk behandling av urinvägsinfektioner . I Bangladesh ger urskillningslös användning av antibiotika många negativa följder för UTI-patienter kliniskt sett med en omfattande ekonomisk börda. Syftet med denna studie var att bedöma känslighetsprofilen hos grampositiva uropatogener mot olika receptbelagda antibiotika. Vår studie har rationaliserat behovet av fortsatt övervakning av urinvägsinfekterade patienter för en bättre förståelse av deras nuvarande epidemiologi av grampositiva bakteriestammar i den bangladeshiska befolkningen.

Metoder och material

Datainsamling

Patienternas sociodemografiska information, behandlingshistorik (om patienterna behandlades med antimikrobiell behandling) och all relevant klinisk information (njursten, graviditet, nyligen användande av kateter) registrerades genom ett strukturerat frågeformulär.

Studieutformning och provtagning

En tvärsnittsstudie genomfördes mellan juli 2018 och december 2018 för att söka grampositiva bakterieisolat från patienter med urinvägsinfektion. Denna studie utformades utifrån laboratorieundersökningar av urinprover som samlades in från UTI-patienter som behandlades på olika samhällssjukhus i Savar-området. För att aktualisera planeringen ombads sannolika UTI-patienter som sökte läkare på Gonosastha Hospital och Enam Medical College i Savar, Dhaka, att delta i denna studie. Studien omfattar patienter med samtycke som har kliniska tecken på urinvägsinfektion med symtom i mindre än sju dagar som presenteras på sjukhusens öppenvårdsavdelning och de som är inlagda i mindre än 48 timmar.

Bakteriell isolering och identifiering

För att isolera patogenen för urinvägsinfektion samlades rena urinprover från mitten av urinströmmen upp i sterila glasrör och ympades på ett differentiellt odlingsmedium, cystein-, laktos- och elektrolytrubbat (CLED) agar (Lyophilchem, Italien). Patienterna förklarades i förväg om standardförfarandet för provtagning med ren fångst i mittströmmen för att undvika kontaminering med kommensala bakterier. För att undvika falskt positiva resultat pläterades urinproverna inom 2 timmar efter insamlingen. Användning av CLED-agar ger fördelar i form av tillväxtstöd för de flesta potentiella uropatogener, inklusive grampositiva kokker som Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus och Enterococcus spp. Parallellt inokulerades Mannitol Salt Agar (MSA) för att rikta in sig på tillväxt av grampositiva urinvägsinfektioner. Urinkulturer inkuberades över natten vid 35ºC-37ºC i omgivande luft. Kvantitativa urinodlingar utfördes, och koloniantal 102 eller 103 CFU/mL ansågs definiera sannolik UTI-infektion hos respektive patient. Kolonier på mindre än 102 CFU/mL ansågs vara en potentiell kontaminering. De renade bakteriekolonierna identifierades genom gramfärgning, konventionella biokemiska förfaranden följt av ett snabbt biokemiskt testkit (API 20E, BioMe´rieux, Durham, NC) som består av en uppsättning kromogena paneler, kolhydratbatterier och enzymatiska substrat. Bakterieidentifiering validerades ytterligare genom genotypning med hjälp av 16S rRNA för isolaten i en del.

Antimikrobiell känslighetsbedömning

Isolaten utsattes för in vitro-antibiotikakänslighetstest med standard Kirby-Bauer-diskdiffusionsmetoden och hämmande zoner tolkades enligt CLSI:s (Clinical amp; Laboratory Standards Institute-2010) rekommendationer. Sex antibiotikadiskar från beta-laktam, nitrofurantoin och fluorokinolon placerades på bakteriegräset och inkuberades vid 37ºC för att bestämma känslighetsmönstret. Känsliga bakterier gav en tydlig zon runt antibiotikaskivan och zondiametern mättes för att jämföras med standarden.

Detektion av β-laktamas- och kinolonresistenta gener

Isolat som uppvisade resistenta fenotyper utsattes för PCR för att detektera blaTEM- och qnrS-genen. Sammanlagt sex bakterielysat framställdes. PCR utfördes i PCR-rör som innehöll bakterielysat som DNA-mall (1 µl) med en slutvolym på 12 µl som innehöll DNA 2x premix (6 µl), 5 pmol av varje primer (1 µl) och avjoniserat vatten (4 µl). PCR utfördes i en termocyklare och cykelförhållandena för bla TEM och qnrS var: inledande denaturering vid 94 °C i 5 minuter följt av 32 amplifieringscykler med denaturering vid 94 °C i 30 sekunder, glödgning vid 50 °C i 30 sekunder (blaTEM) och 55 °C i 30 sekunder (qnrS) och förlängning vid 72 °C i 1 minut, avslutat med en slutlig förlängning vid 72 °C i 7 minuter. PCR-produkter av förväntad storlek renades och sekvenserades med samma primers som användes för att generera PCR-produkterna.

Statistiska analyser

Som beskrivits användes den validerade Bangla-versionen av frågeformuläret för datainsamling. Ifyllda blanketter för datainsamling kontrollerades på nytt av handledare för datainsamling. Slumpmässigt utvalda 10 % laboratorieanalyser utfördes två gånger av olika forskare för att säkerställa laboratoriedatas äkthet och för att bedöma bias mellan forskarna. Kontrollerade uppgifter fördes in och analyserades därefter med hjälp av IBM SPSS Statistics data editor (version 21). Saknade uppgifter exkluderades från den bivariata analysen. Beskrivande statistik rapporterades som frekvens, procentandel och medelvärden i förekommande fall tillsammans med standardavvikelse. Testbakteriernas antimikrobiella känslighet utvärderades med hjälp av en kategorisk skattningsskala av tre typer: mottaglig (antibiotikum som anges som helt effektivt), intermediär (som anges som delvis effektivt) och resistent (som anges som icke-effektivt). För att testa sambandet mellan kategoriska data användes Pearsons chi-två-test, och Yates korrigering för kontinuitet tillämpades vid behov. Exponeringen av antimikrobiella medel för förvärv av antibiotikaresistenta gener beräknades. Korrelationskoefficienten beräknades för att kontrollera styrkan i sambandet. Oberoende t-test utfördes för att jämföra medelvärdena för kontinuerliga variabler. Ett tvåsvansat p-värde mindre än 0,05, ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Demografi för studiepopulationen

Vi kontaktade patienter som besökte läkare på Gonosatha Medical College med sina UTI-associerade komplikationer. Vi inkluderade 147 patienter i denna studie som hade allvarliga kliniska symtom. Av dem var 36 (24,5 %) män och resterande 111 (75,5 %) kvinnor. Därför befanns nästan tre gånger fler UTI-patienter vara kvinnor i jämförelse med det motsatta könet (figur 1). Chi-square-testet visade att kvinnligt kön var förknippat med ett signifikant högre antal UTI-händelser (p = 0,04). Åldersfördelningen för våra undersökningsfall ligger från under ett år till över 70 år. Den vanligaste UTI-infektionen fanns dock i åldersgruppen mellan 21-30 år. Den övergripande åldersfördelningen av fallen beskrivs i tabell 1. Totalt fem av 12 Staphylococcus spp (42 %) identifierades i åldersgruppen 21-30 år. Ingen annan trend observerades i åldersfördelningen infektion av grampositiv UTI-infektion.

Figur 1. Fördelning av grampositiva och gramnegativa bakterier bland män och kvinnor. Kvinnor hade ett signifikant högre antal UTI än män som orsakades av gramnegativa bakterier. När det gäller grampositiva urinvägsinfektioner uppvisade män och kvinnor lika stor sårbarhet

Tabell 1. Ålder-fördelning av UTI-studiepatienter

Isolering och identifiering av gram-positiva UTI-patogener

Vi undersökte 147 urinprover från kliniskt symtomatiska patienter. CLED-kulturmediet gav olika färgkolonier för olika UTI-patogener. Gram-positiva Staphylococcus aureus producerar gula kolonier och Staphylococcus saprophyticus genererar vita till gulaktiga kolonier, och Enterococcus spp producerar färglösa till gula kolonier där. Gramnegativa bakterier producerar olika andra färger. Att identifiera UTI-bakterier genom att observera kolonifärger på CLED kan därför vara presumtivt, men svårt att dra slutsatser. Vi subkulturerade de troliga grampositiva kolonierna från CLED-kulturmediet till Mannitol Salt Agar (MSA) och inkuberade dem över natten vid 37 °C. Tillväxtkolonierna på MSA var vita till gulaktiga och rosa. Bakterierna från MSA genomgick en Gram-färgning och visade sig vara Gram-positiva. De preliminära grampositiva UTI-bakterier som identifierades i denna studie är Staphylococcus species. Analys av analytiskt profileringsindex (API) och/eller 16sRNA-dna-sekvensering kan göras för att identifiera etiologin på artnivå. Vi har upptäckt 12 grampositiva UTI-patogener, vilket var 8,2 % av den totala patogenpopulationen.

Antimikrobiellt resistensmönster hos de grampositiva UTI-isolaten

Skivdiffusionsexperimentet gav tydliga zoner av bakteriell gräsmatta på Muller-Hinton-agar (MH-agar), vilket tyder på mottaglighet för respektive antibiotika som impregnerats där. Resistenta isolat gav däremot inte upphov till tydliga zoner ens i närvaro av antibiotikaskivan. I vår bedömning observerades en blandad trend när det gäller känslighet för de testade antibiotika. Den högsta resistensen hittades mot nitrofurantoin (91,7 %), följt av amoxicillin (83 %) och ofloxacillin (50 %). Både gentamicin och amikacin befanns vara mycket effektiva läkemedel, där endast 8,3 % befanns vara resistenta (figur 2).

Figur 2. Prevalens av antibiotikaresistens bland grampositiva UTI-bakterier.
AMC: Amoxicillin; LOM: Lomefloxacin; OFX: Ofloxacin; CN: Gentamicin; AK: Amikacin; F: Nitrofurantoin. Amikacin och gentamicin visade sig vara de mest effektiva antibiotika mot grampositiva UTI-bakterier. Nitrofurantoin visade sig vara minst effektivt bland de testade antibiotika.

Antibiotikaresistenta gener i grampositiva uropatogener

Vi framställde DNA-prover från alla 12 grampositiva isolat med hjälp av värmekokningsmetoden. Cellväggarna hos grampositiva bakterier är vanligtvis mycket styvare än gramnegativa bakterier, vilket kan påverka frigörandet av DNA vid värmekokningsmetoder. I den aktuella analysen undersökte vi beta-lactamring som innehåller den antibiotikaresistenta genen bla-TEM och fann två isolat (2/6, 33 %) isolat positiva. På samma sätt kontrollerade vi fluorkinolongruppens antibiotikaresistenta gen qnr-S och fann tre isolat positiva (3/6, 50 %).

Diskussion

Urinvägsinfektioner utgör en av de vanligaste sjukdomarna som påträffas i medicinsk praxis, orsakar betydande associerad sjuklighet och förekommer från nyfödda till äldre . Prevalensen av infektioner kan variera med ålder, kön och vissa predisponerande faktorer. De flesta av de rapporterade urinvägsinfektionerna orsakades av gramnegativa bakterier, främst Enterobacteriaceae. Det fanns också starka bevis för grampositiv UTI-infektion. Vi försökte undersöka prevalensen av grampositiva UTI-patogener i den bangladeshiska befolkningen. Empiriska behandlingar av urinvägsinfektioner baserade på svårighetskriterier och kliniska symtom innebär en stor utmaning . Eftersom antibiotikabehandling av grampositiva bakterier är helt annorlunda än antibiotikabehandling av gramnegativa UTI-patogener är risken stor att man får fel behandling genom ett empiriskt tillvägagångssätt. Därför är en korrekt diagnos med specifika antibiotikakänslighetstester absolut nödvändigt för att fastställa en god förvaltning av behandlingen. UTI är en vanlig samhällsförvärvad sjukdom i Bangladesh och därför smittas en betydande andel av befolkningen med denna sjukdom varje år. Studien var utformad för att kontrollera antimikrobiell känslighet även hos grampositiva UTI-patogener. Vi upptäckte cirka 8,2 % grampositiva UTI etiologier, särskilt Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus och Enterococcus spp. som bifogade tidigare publicerade rapporter .

Samhälleligt registrerades UTI-infektioner i mycket högre grad hos kvinnor än hos män . Osannolikt fann vi att hälften av den grampositiva infektionen rapporterades hos män. De preliminära resultaten visade att män är mer sårbara för grampositiva infektioner jämfört med den allmänna situationen. Åldersfördelningen för våra undersökningsfall ligger från under ett år till över 70 år. Den vanligaste grampositiva UTI-infektionen fanns dock i åldersgruppen 21-30 år, vilket stöds på annat håll.

Antibiotikaresistens bland uropatogener har blivit ett folkhälsoproblem i Bangladesh. I denna studie fastställdes antibiotikakänslighetsprofiler hos grampositiva UTI-patogener med sex olika antibiotikadiskar genom diskdiffusionstest. Den högsta procentuella resistensen observerades mot nitrofurantoin, medan den lägsta procentuella resistensen konstaterades mot amikacin och gentamicin. Mindre än 10 % av de grampositiva uropatogenerna visade sig vara resistenta mot dessa två antibiotika från aminoglykosidgruppen. Resultaten stöder aminoglykosid som ett läkemedel att välja för grampositiva UTI-patogener. Bland antibiotika från kinolongruppen var det lomefloxacin av andra generationen som hade den högsta resistensprocenten (75 %). Våra antibiogramfynd visade att nitrofurantoin inte var ett särskilt effektivt läkemedel för grampositiva UTI-bakterier. Det gamla beta-laktamantibiotikumet amoxicillin var svagt funktionellt mot grampositiva UTI-patogener. Fluorokinolonantibiotika, ofloxacillin och lomefloxacin visade sig vara måttligt effektiva.

Isolaten testades för utvalda AMR-gener genom polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av primers som var specifika för detektion av bla-TEM och qnrS. Cirka 33 % av isolaten var positiva för bla-TEM och 50 % var positiva för qnrS. Antibiotikaresistenta gener upptäcktes och överensstämde med det fenotypiska känslighetsmönstret. Även om man med största uppriktighet och hängivenhet undersökte att genomföra studien kunde den inte överträffa begränsningar eftersom urvalet inte var tillräckligt stort. Trots denna begränsning kommer resultatet av studien förhoppningsvis att hjälpa kliniker att besluta om att förskriva antibiotika utifrån en evidensbaserad studie. Klinikern bör ta hand om den specifika diagnosen innan empirisk antibiotikabehandling förskrivs, särskilt för manlig UTI.

Etiskt uttalande

Denna studie godkändes av etik- och forskningsgranskningskommittén vid Jahangirnagar-universitetet, fakulteten för biologiska vetenskaper och muntligt samtycke inhämtades från UTI-patienter och läkare.

Acknowledgments

Författarna vill tacka de respektive patienterna och läkarna för deras samarbete. Författarna tackar för bidraget från personalen vid det allmänna laboratoriet, institutionen för mikrobiologi, Jahangirnagar University.

Offentliggörande

Detta arbete stöddes delvis av Grant for Advance Research (GARE), Ministry of Education and The Ministry of Science and Technology Research Grant, Bangladesh, till Dr. Md. Salequl Islam.

1. Stamm WE, Norrby SR (2001) Urinary tract infections: disease panorama and challenges. J Infect Dis 183: S1-S4.
2. Hooton TM (2012) Clinical practice. Okomplicerad urinvägsinfektion. J Infect Dis 366: 1028-1037. Epub 2012/03/16.
3. Piette A, Verschraegen G (2009) Role of coagulase-negative staphylococci in human disease. Vet Microbiol 134: 45-54.
4. Edwards MS, Baker C (2005) Grupp B-streptokockinfektioner. GROUP 12:c0060.
5. Matthews SJ, Lancaster JW (2011) Urinvägsinfektioner hos den äldre befolkningen. Am J Geriatr Pharmacother 9: 286-309.
6. Kline KA, Lewis AL (2016) Grampositiva uropatogener, polymikrobiella urinvägsinfektioner och den nya mikrobiotan i urinvägarna. Microbiol Spectr 4: 2.
7. Clouse K, Shehabi A, Suleimat AM, Faouri S, Khuri-Bulos N, et al. (2019) High prevalence of Group B Streptococcus colonization among pregnant women in Amman, Jordan. BMC pregnancy and childbirth 19: 177.
8. de Sousa VS, da-Silva APS, Sorenson L, Paschoal RP, Rabello RF, et al. (2017) Staphylococcus saprophyticus Recovered from Humans, Food, and Recreational Waters in Rio de Janeiro, Brazil. Int J Microbiol 2017: 4287547
9. Lee DH, Klinkova O, Kim JW, Nanjappa S, Greene JN (2019) A Case Series of Staphylococcus lugdunensis Infection in Cancer Patients at an Academic Cancer Institute in the United States. Infect Chemo 51: 45-53.
10. Kunin CM (1994) Urinvägsinfektioner hos kvinnor. Clin Infect Dis 18: 1-10.
11. Croxen MA, Finlay BB (2010) Molekylära mekanismer för Escherichia coli-patogenitet. Nat Rev Microbiol 8: 26-38.
12. Grude N, Tveten Y, Kristiansen BE (2001) Urinvägsinfektioner i Norge: bakteriell etiologi och känslighet. En retrospektiv studie av kliniska isolat. Clin Microbiol Infect 7: 543-547.
13. Falagas ME, Giannopoulou KP, Kokolakis GN, Rafailidis PI (2008) Fosfomycin: användning utöver urinvägs- och gastrointestinala infektioner. Clin Infect Dis 46: 1069-1077.
14. Stamm WE, Counts GW, Running KR, Fihn S, Turck M, et al. (1982) Diagnostik av koliforma infektioner hos kvinnor med akut dysuri. N Engl J Med 307: 463-468.
15. Detweiler K, Mayers D, Fletcher SG (2015) Bacteruria and Urinary Tract Infections in the Elderly. Urol Clin North Am 42: 561-568.
16. Arshad M, Seed PC (2015) Urinvägsinfektioner hos spädbarn. Clin Perinatol 42: 17-28.
17. Tien BYQ, Goh HMS, Chong KKL, Bhaduri-Tagore S, Holec S, et al. (2017) Enterococcus faecalis Promotes Innate Immune Suppression and Polymicrobial Catheter-Associated Urinary Tract Infection. Infect Immun pii: e00378-17.
18. Vasquez V, Ampuero D, Padilla B (2017) Urinary tract infections in inpatients: that challenge. Rev Esp Quimioter 30: S39-S41.
19. Hooton TM, Stamm WE (1997) Diagnos och behandling av okomplicerad urinvägsinfektion. Infect Dis Clin North Am 11: 551-581.
20. Medina M, Castillo-Pino E (2019) En introduktion till epidemiologi och belastning av urinvägsinfektioner. Ther Adv Urol 11: 1756287219832172.
21. Wallmark G, Arremark I, Telander B (1978) Staphylococcus saprophyticus: en frekvent orsak till akut urinvägsinfektion bland kvinnliga öppenvårdspatienter. J Infect Dis 138: 791-797.