Crearea de sisteme de transformare genetică a permis oamenilor de știință să transforme ADN străin în ciuperci filamentoase și să obțină astfel tulpinile dorite în scopuri industriale. Acum putem profita pe deplin de puterea superioară de secreție a ciupercilor și de eficiența lor excelentă în producerea de metaboliți valoroși.

Transformarea mediată de protoplaste (PMT)

PMT este cea mai frecvent utilizată metodă de transformare fungică, care se bazează pe un număr mare de protoplaști fungici competenți. Principiul constă în utilizarea unor enzime disponibile în comerț pentru a elimina componentele complexe ale peretelui celular fungic pentru a genera protoplaști. Ulterior, se folosesc unii reactivi chimici (cum ar fi PEG) pentru a promova fuziunea dintre acizii nucleici exogeni și protoplaști, după cum se descrie mai detaliat mai jos. Componentele peretelui celular fungic sunt foarte variabile între diferitele tulpini. Chiar și componentele învelișului sporilor sunt semnificativ diferite de cele ale hifelor din aceeași tulpină . Astfel, nu există o metodă universală de transformare care să poată fi aplicată la diferite tulpini fungice. Pregătirea protoplastului poate fi cu greu standardizată. O parte a dificultăților provine din cunoștințele noastre limitate despre hidrolazele peretelui celular. Dezvoltarea unei metode PMT optimizate pentru ciuperci necesită încă un efort semnificativ.

PMT este o metodă de transformare utilizată în mod curent. Metoda a fost în mod constant îmbunătățită pentru a obține o eficiență mai mare pentru transformarea genetică și pentru direcționarea unor loci genetici adecvați prin editare genetică. Pregătirea protoplastelor necesită îndepărtarea peretelui celular, care se realizează în principal prin tratament enzimatic. Au fost raportate, de asemenea, metode neenzimatice de preparare a protoplastelor, cum ar fi metodele fizice, inclusiv măcinarea și șocul cu unde supersonice . Cu toate acestea, ele nu sunt utilizate pe scară largă din cauza inconvenientelor practice și a randamentului scăzut al protoplastelor. În tabelul 1 este prezentat un rezumat al protoplastelor de transformare mediată de protoplaste pentru diferite specii de ciuperci.

Etapele de bază ale metodei PMT

PMT a fost aplicată pentru prima dată la Saccharomyces cerevisiae. Cercetătorii au preparat protoplastele cu melița comercială și au folosit sorbitol pentru a conserva protoplastele. Ulterior, o astfel de metodă a fost aplicată la ciuperci filamentoase, cum ar fi Neurospora crassa , și A. nidulans . Deși metodele de transformare au fost îmbunătățite, etapele de bază rămân, în esență, aceleași. Etapele de bază ale metodei PMT sunt prezentate în Fig. 1.

Etapele de bază ale transformării mediate de protoplaste

Prepararea protoplastelor

Prima etapă în pregătirea protoplastelor este îndepărtarea peretelui celular prin digestie enzimatică. Peretele celular al ciupercilor este alcătuit din glucan, manan și chitină. Structura peretelui celular fungic este foarte dinamică, iar peretele celular variază în timpul diviziunii celulare și al creșterii ciupercilor, precum și în timpul germinării sporilor, al ramificării hifelor și al formării diafragmei. Componentele peretelui celular sunt, de asemenea, diferite la diferite specii fungice, prin urmare, ar trebui să se utilizeze diverse enzime în combinație. S-a raportat că selectarea unui amestec adecvat de enzime este un factor cheie în prepararea protoplastului .

În general, hifele sunt sensibile la o enzimă adecvată care să îi hidrolizeze peretele celular în timpul fazei logaritmice. În procedura PMT de Neurospora, protoplaștii se prepară prin hidroliza hifelor nou-născute (cultură timp de 4-6 h la 25-30 °C) . În mod similar, protoplastele pot fi preparate și cu conidiospori. De exemplu, pentru Aspergillus și Penicillium, se pot alege spori germinali sau talii .

Protoplastele sunt sensibile la presiunea osmotică, trebuie să se aibă grijă să se mențină o presiune osmotică stabilă pentru a păstra protoplastele intacte în timpul enzimolizei pereților celulari. Astfel, stabilizatorii osmotici (cum ar fi sorbitolul, clorura de sodiu și clorura de potasiu) ar trebui să fie incluși în toate tampoanele pentru prepararea protoplastelor pentru a evita ruperea celulelor. De exemplu, soluția de sorbitol cu o concentrație de 0,8-1,2 M este utilizată în prepararea protoplastelor de N. crassa , Aspergillus sp. și Trichoderma sp. pentru a menține stabilitatea osmotică a protoplastelor. În tabelul 2 este prezentat un rezumat al parametrilor de preparare a protoplastelor pentru unele specii fungice comune.

Absorbția ADN-ului exogen

Soluția utilizată pentru suspendarea protoplastelor conține, de obicei, ioni de calciu și stabilizatori osmotici. Se consideră că calciul deschide canale în citomembrană, ceea ce facilitează intrarea ADN-ului exogen în celulă, în timp ce stabilizatorii osmotici sunt necesari pentru menținerea morfologiei protoplastelor. De obicei, o anumită cantitate de polietilenglicol (PEG) se adaugă împreună cu ADN purificat (care poate fi fie ADN circular bicatenar, fie ADN liniarizat). PEG este un promotor de fuziune celulară utilizat în mod obișnuit . Acesta poate forma puntea moleculară între celule sau între citomembrană și ADN și, astfel, promovează adeziunea. În plus, poate, de asemenea, să inducă sarcini dezordonate pe suprafața citomembranei, să modifice permeabilitatea membranei și să faciliteze intrarea acizilor nucleici exogeni în celule .

PEG este un agent crucial care sporește eficiența transformării. În majoritatea cazurilor, eficiența scăzută a transformării poate fi îmbunătățită prin adăugarea de mai mult PEG. În condiții normale, performanța PEG-ului cu greutate moleculară mică (cum ar fi PEG3000) este superioară celei a PEG-ului cu greutate moleculară mare (cum ar fi PEG8000). Cu toate acestea, acest lucru trebuie optimizat pentru diferite specii .

Eficiența de transformare este, de asemenea, influențată de temperatură. În general, amestecul de ADN și protoplaste trebuie plasat la gheață timp de 15-30 min, astfel încât ADN-ul să poată adera la suprafața protoplastelor .

Regenerarea protoplastelor

Pentru a garanta o bună recuperare a protoplastelor viabile, protoplastele sunt lăsate să se recupereze pe placă fără presiune de selecție pentru o anumită perioadă înainte de a fi transferate pe o placă selectivă. În cultura de regenerare trebuie inclus un stabilizator osmotic. Presiunea osmotică stabilă este factorul cheie pentru ca protoplastul să regenereze peretele celular. Numai protoplastele care poartă acizi nucleici exogeni se pot dezvolta pe mediul selectiv.

Comentariile privind metoda PMT

Metoda de transformare a protoplastelor este simplă și eficientă, fără a fi nevoie de echipamente costisitoare. Dar protocolul implică multe etape și reactivi critici. Fiecare etapă trebuie să fie optimizată și calitatea reactivilor trebuie să fie testată în mod critic. Starea de creștere a ciupercilor care sunt transformate trebuie să fie monitorizată cu atenție. Experiența este esențială pentru implementarea cu succes a acestei metode.

Transformarea mediată de Agrobacterium (AMT)

Agrobacterium este o bacterie Gram-negativă care se găsește în mod obișnuit în sol. Agrobacterium tumefaciens poate infecta plantele rănite. Plasmidul inductor de tumori de > 200 kb, care este denumit și plasmidă Ti, a putut fi izolat în stadiul incipient al infecției. Atunci când A. tumefaciens infectează o plantă, acesta pătrunde în plantă prin rană și integrează o parte din plasmidul Ti în genomul celulelor vegetale infectate. Fragmentul de ADN integrat din plasmidul Ti este denumit în mod obișnuit ADN de transfer sau ADN-T. ADN-T se inserează în genomul plantei în mod aleatoriu sub formă de monoclon. ADN-T este flancat de două repetări imperfecte direcționale (numite granița stângă și granița dreaptă) și conține gene care codifică enzimele responsabile de formarea hormonilor vegetali, care determină creșterea tumorilor . A fost proiectat un vector binar pentru a avea gena țintă inserată între marginile stânga și dreapta ale ADN-T, iar plasmidul recombinant a fost transformat în Agrobacterium tumefaciens. Clona Agrobacterium pozitivă a fost utilizată ca vehicul pentru a integra gena țintă în genomul ciupercii. Etapele specifice vor fi discutate în detaliu mai jos.

Metoda AMT s-a dovedit a fi mai stabilă și mai eficientă decât metodele de transformare convenționale încă de la prima lucrare care a raportat că această metodă poate fi aplicată la transformarea fungilor. Metoda AMT a fost aplicată pentru prima dată pentru a transforma S. cerevisiae . O plasmidă purtătoare a unei gene de rezistență la higromicină este utilizată în mod obișnuit pentru a transforma Aspergillus awamori . Metoda AMT a fost aplicată la multe Ascomicete, inclusiv Aspergillus , și Monascus purpureus . Etapele de bază ale metodei AMT sunt prezentate în figura 2. În tabelul 3 este prezentat un rezumat al protocolului de transformare mediat de Agrobacterium pentru diferite specii fungice.

Etapele de bază ale transformării mediate de Agrobacterium

Factori care influențează eficiența AMT

Mulți factori afectează eficiența AMT, inclusiv tipul de material fungic de plecare (protoplast, spor, hifa și țesutul corpului fructului), concentrația acetosingonei, raportul dintre ciupercă și Agrobacterium și condițiile de co-cultură.

2. Tipul de material fungic de plecare Metoda AMT poate folosi protoplaști, spori, hife și țesutul corpului de fruct al ciupercilor ca recipient. Trebuie să se selecteze materiale de plecare adecvate pentru diferite tulpini. De exemplu, metoda AMT funcționează numai pentru protoplastele de Rhizopus. oryzae și Mucor circinelloides, în timp ce sporii sau sporii germinali nu ar produce transformanți .

3. Concentrația de acetosingură (AS) AS acționează în două etape în timpul procesului AMT. Una este procesul de inducție, iar cealaltă este procesul de transformare. AS este utilizat, în general, pentru a induce expresia domeniului Vir al ADN-T, iar gena din domeniul Vir activează transferul ADN-T. Numeroase studii au demonstrat că este necesară o cantitate adecvată de AS în timpul procesului de transformare. Cu toate acestea, adăugarea de AS nu este absolut necesară în timpul etapei de precultivare a Agrobacterium, ceea ce ar putea reduce eficiența transformării pentru anumite tulpini. Concentrația de AS este un factor important care afectează eficiența transformării în timpul procesului de co-cultură ciupercă-Agrobacterium în AMT de Aspergillus awamori .

4. Raportul dintre ciuperci și Agrobacterium În anumite limite, eficiența transformării va atinge nivelul maxim odată cu creșterea cantității de ciupercă sau Agrobacterium. Un raport optim pentru AMT pentru diferite ciuperci trebuie să fie determinat empiric. Raportul dintre cantitatea de celule fungice și cea de celule bacteriene trebuie să fie optimizat pentru diferite sisteme de transformare ciupercă-Agrobacterium.

5. Condiția de cocultură Condițiile de cocultură sunt un factor important în metoda AMT. Aceasta include timpul de cultură, temperatura, pH-ul și selectarea filtrului. Temperatura și timpul pentru co-cultură sunt factorii cheie dintre etapele AMT. În cazul transformării ciupercă-Agrobacterium, o condiție adecvată pentru a începe este o temperatură de 20-28 °C și un timp de co-cultură de 16-96 h. O temperatură mai scăzută (20-25 °C) este, de obicei, benefică pentru metoda AMT. Filtrul, care este hidrofil și servește drept suport pentru co-cultură ciupercă-Agrobacterium, facilitează transferul de colonii unice pe placa de screening. Ca filtru se poate folosi o membrană de nitroceluloză, o membrană de nailon, hârtie de filtru, celofan și o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) .

Comentarii privind transformarea mediată de Agrobacterium

Metoda AMT deschide o nouă cale pentru acele ciuperci recalcitrante la transformarea prin metode convenționale. Metoda AMT este deosebit de potrivită pentru a genera mutații knock-in la ciuperci, deoarece ADN-T se inserează în mod aleatoriu în genom ca o singură copie. În plus, AMT poate atinge o eficiență ridicată a recombinării omoloage în diverse experimente de direcționare a genelor .

Vantajele majore ale metodei AMT includ: în primul rând, recipienți de transformare diversificați, inclusiv protoplaști, hife și spori; în al doilea rând, capacitatea de a integra genele exogene în genom pentru a forma transformanți stabili; și în al treilea rând, eficiența ridicată a transformării, rezultând un număr mare de transformanți .

Metoda AMT necesită vectori binari, care sunt dificil de pregătit. Este necesar să se ia în considerare mai mulți factori în optimizarea procesului de transformare. Aceasta este o limitare majoră a metodei AMT .

Transformarea prin electroporare

Electroporarea este o metodă de transformare simplă, rapidă și eficientă pentru ciupercile filamentoase. În electroporare, sarcinile electrice sunt stocate într-un condensator pentru a construi o tensiune înaltă, proba este lovită de impulsul de tensiune, iar acidul nucleic exogen poate fi transferat instantaneu în celule. De obicei, în transformarea ciupercilor se utilizează unde pătrate sau unde de descreștere exponențială . Impulsurile de descreștere exponențială sunt generate prin simpla încărcare și descărcare a unui condensator. Câmpul electric scade exponențial de la valoarea de vârf. O undă pătrată este o formă de undă periodică nesinusoidală (care poate fi reprezentată ca o însumare infinită de unde sinusoidale), în care amplitudinea alternează la o frecvență constantă între valori minime și maxime fixe. Diferite forme de undă de electroporare sunt utilizate pentru diferite specii. În tabelul 4 este prezentat un rezumat al formelor de undă utilizate în electroporare pentru diferite specii.

Când o celulă este expusă la câmpul electric, structura citomembranei va fi modificată cu o tensiune indusă între citomembrane. Se pot forma micropori în citomembrană după șocul electric. Permeabilitatea indusă a peretelui celular este reversibilă în limitele pragurilor de tensiune și de durată, în caz contrar, va provoca leziuni ireversibile ale celulelor. Prin urmare, microporii din citomembrană par să aibă două modele după un șoc electric, unul reversibil și altul ireversibil. Moleculele lipidice și proteice din citomembrană își pot reface structura inițială atunci când se aplică o intensitate adecvată a câmpului, în timp ce șocul electric ireversibil va da naștere la ireparabilitate sau la o recuperare extrem de lentă, ceea ce duce în cele din urmă la moartea celulelor . ADN-ul exogen poate fi transferat în bacterii, protoplaste de plante, celule animale și ciuperci filamentoase prin electroporare. Această metodă a fost aplicată cu succes la mai multe ciuperci. Ozeki et al. au descoperit că sporii germinali sunt mai ușor de transformat prin electroporare. În ultimii ani, electroporarea a devenit o metodă fiabilă pentru transformarea genetică a unor tulpini comune . În tabelul 5 este prezentat un rezumat al protocoalelor de transformare mediată prin electroporare pentru diferite specii fungice.

Factori care influențează transformarea prin electroporare

Parametri de electroporare

1. Intensitatea câmpului electric Intensitatea câmpului electric este cel mai important factor care influențează eficiența electroporării. Atunci când intensitatea câmpului electric aplicat atinge magnitudinea de kV/cm și lățimea impulsului la scara μs-ms, citomembrana va fi modificată și se vor genera mulți micropori pe pereții celulari . Intensitatea mare a câmpului electric este asociată cu o rată mare de absorbție a acizilor nucleici exogeni și cu o rată mai mică de supraviețuire a celulelor. Cu toate acestea, diferite tipuri de celule necesită intensități diferite ale câmpului electric datorită diferențelor dintre componentele citomembranelor . Se formează puțini micropori atunci când intensitatea câmpului electric nu depășește pragul necesar. Dimpotrivă, o intensitate excesivă a câmpului electric va duce la deteriorarea ireversibilă a citomembranei, ceea ce duce la moartea celulelor .

2. Capacitanță În timpul procesului de electroporare, variația sarcinilor electrice și intensitatea câmpului electric aplicat suspensiei celulare depind de capacitate și de durata impulsului. Intensitatea și durata impulsului sunt, de asemenea, influențate de capacitate, prin urmare, o capacitate mai mare are efecte de transformare mai bune .

3. Durata și frecvența impulsului Durata perforării pe citomembrană, care este direct legată de eficiența transformării prin electroporare, este influențată de durata și frecvența impulsului .

Mediul de electroporare și factorii externi

1. Soluția tampon Soluția tampon asigură un mediu important pentru electroporarea celulelor, iar valoarea pH-ului soluției tampon de șoc electric este de mare importanță. În mod normal, se utilizează un tampon cu pH 7,0. Celulele sunt ușor perforate și ucise la un pH mai mare de 7,0 .

2. Temperatura În timpul procesului de electroporare se produce o cantitate mare de căldură, care va fi eliberată în soluția tampon. Prin urmare, se recomandă o temperatură redusă (0-4 °C) pentru un efect mai bun . În plus, îmbăierea cu gheață a amestecului de preșoc electric poate îmbunătăți, de asemenea, eficiența șocului electric.

3. Concentrația de acid nucleic exogen În general, eficiența electroporării crește odată cu concentrația de acid nucleic exogen. ADN-ul superhelix compact pătrunde mai ușor în celule prin citomembrană. În 1995, un studiu a raportat că fiecare 1 μg de ADN plasmidic ar putea genera 100 de transformanți pentru A. niger .

Comentarii privind metoda de electroporare

Metoda de electroporare a fost aplicată pe scară largă la numeroase tipuri de celule, inclusiv procariote și eucariote. Această tehnologie are potențialul de a fi metoda de alegere pentru transformarea unor specii fungice neexplorate. În comparație cu metoda PMT, în care sunt implicați pași complicați, electroporarea este simplă și mai convenabilă. Cu toate acestea, mecanismul de electroporare rămâne încă neclar. Rata de perforare a citomembranei depinde de mulți parametri ai câmpului electric. Și, de asemenea, necesită condiții tampon adecvate pentru a avea o eficacitate optimă.

Transformarea biologică

Transformarea biologică este cunoscută și sub numele de bombardament cu particule. Principiul său este că ADN-ul străin este adsorbit pe suprafața particulelor de tungsten sau de aur. Sub impulsul unei presiuni ridicate, particulele sunt injectate în celulele gazdă. Bombardamentul cu particule poate realiza atât o transformare stabilă, cât și una tranzitorie.

Diferiți factori afectează eficiența bombardamentului în modele de interacțiuni complexe . Parametrii biologici (tipul de celule, condițiile de creștere și densitatea celulelor) și setările instrumentale (tipul și dimensiunea particulelor, nivelul de vid și de presiune, distanța față de țintă) sunt variabile importante .

Bombardamentul cu particule este cea mai puternică dintre toate metodele de transformare genetică. Ea nu este supusă limitărilor legate de tipurile de celule ale gazdei sau ale speciilor. În cazul ciupercilor, bombardamentul cu particule este suficient de eficient pentru acele organisme care sunt dificil de cultivat sau din care protoplatele sunt greu de preparat. Bombardamentul cu particule este ușor și convenabil de utilizat. Cu toate acestea, instrumentele și consumabilele pentru bombardamentul cu particule sunt costisitoare. Aceasta va fi luată în considerare numai în cazul în care alte metode nu funcționează. În prezent, bombardamentul cu particule a fost utilizat pentru a transforma cu succes A. nidulans și T. reesei , etc.

Transformarea mediată de unde de șoc (SWMT)

SWMT utilizează principiul transformării și transmiterii energiei pentru a genera o perturbare tranzitorie a presiunii și o forță de răsucire de-a lungul celulelor pentru a forma un efect de cavitație tranzitorie . Această metodă a fost aplicată în tratamente medicale, cum ar fi ortopedie și zdrobirea pietrelor la rinichi . SWMT modifică permeabilitatea membranelor celulare prin cavitație acustică, ceea ce duce la absorbția acidului nucleic exogen în celule. Metoda a fost utilizată cu succes pentru a introduce acidul nucleic exogen în Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa și Salmonella typhimurium . În 2013, Denis Magaña-Ortíz et al. au raportat pentru prima dată aplicarea SWMT pentru ciuperci, inclusiv A. niger, Fusarium oxysporum și Phanerochaete chrysosporium . În acest articol, au fost remarcate trei avantaje ale metodei SWMT. În primul rând, în comparație cu metodele de transformare convenționale, această metodă este capabilă să acționeze direct asupra sporilor, dar nu și asupra protoplaștilor. În al doilea rând, parametrii fizici au fost ușor controlabili, doar numărul de spori, energia și viteza undei de șoc trebuind să fie controlate cu precizie. În al treilea rând, eficiența transformării a fost excelentă. Rezultatele lui Denis Magaña-Ortíz et al. au indicat că, în comparație cu metoda de transformare cu Agrobacterium, metoda SWMT ar putea spori eficiența transformării de 5400 de ori pentru A. niger .

Dar au fost, de asemenea, notabile unele limitări ale acestei metode de transformare. Deoarece o mare parte din ADN este deteriorată în tratamentul cu unde de șoc, eficiența transformării, determinată de raportul dintre ADN și celule, a fost destul de scăzută . Cu toate acestea, pentru numărul de celule implicate, eficiența transformării a fost semnificativ mai mare . În evaluarea eficienței, trebuie să se ia în considerare două aspecte: cantitatea de ADN și numărul de celule. De exemplu, în experimentul realizat de Magana-Ortiz și colab. , în general, ADN-ul plasmidic utilizat în transformarea protoplastului și electroporarea este de aproximativ 1-10 μg . Este costisitor și incomod să se producă o cantitate atât de mare de plasmidă în laborator pentru metoda SWMT. În plus, sursele și instrumentele cu unde de șoc sunt costisitoare, deoarece sunt concepute în primul rând pentru scopuri medicale. Acest lucru se dovedește a fi un obstacol major în calea adoptării acestei metode într-un laborator de microbiologie cu resurse limitate.

.