Results and Discussion

Noua noastră metodă AMHS este facilitată de structura anatomică/funcțională a sistemului circulator al albinelor. Circulația este forțată de contracția pulsatorie a diafragmelor dorsală și ventrală, care pompează hemolimfa în inimă. Apoi, aorta transportă hemolimfa în cap (Fig. 1F) , furnizând hemolimfa către creierul și antenele albinei.

În comparație cu TCHS, AMHS a permis colectarea a 80-100 μL de hemolimfă sterilă într-un timp mai scurt și de la un număr mai mic de indivizi, ceea ce a minimizat riscul de melanizare. Considerăm că, în timpul recoltării hemolimfei, este important să se reducă la minimum timpul de contact al acesteia cu aerul. Riscul de melanizare este redus cu un timp de colectare mai scurt și o trecere mai rapidă la etapa de răcire. Pe lângă scurtarea timpului de colectare, utilizarea redusă a insectelor reprezintă un alt avantaj substanțial al AMHS față de TCHS. Cercetarea în domeniul apicelor ar trebui să fie întotdeauna concepută astfel încât să se reducă la minimum numărul de albine care trebuie să fie rănite. Utilizarea AMHS pentru a reduce numărul de albine necesare pentru a colecta un volum de hemolimfă necesar este în concordanță cu principiile directoare pentru o utilizare mai etică a animalelor în cercetare .

Rezultatele noastre prezente au arătat, de asemenea, că dimensiunea mai mare a insectelor a fost asociată cu o prelevare mai ușoară și mai rapidă a hemolimfei și cu volume mai mari de hemolimfă colectată (tabelul 1). Prelevarea de hemolimfă de la Apis mellifera carnica și de la lucrătoare Apis cerana a durat mai mult și a necesitat mai multe insecte decât prelevarea de hemolimfă de la bondari, deoarece primele specii sunt considerabil mai mici și au mai puțină hemolimfă.

Hemolimfa este cel mai adesea obținută cu ajutorul capilarelor prin diferite metode, de exemplu, prin puncția inimii, a sinusului toracic dorsal sau ventral, sau a aortei dorsale . Fiecare dintre aceste proceduri comportă riscul ca ventriculul să fie perforat, ceea ce duce la contaminarea probei cu conținutul intestinului. O astfel de contaminare nu numai că face ca proba să fie inutilizabilă, dar necesită, de asemenea, înlocuirea capilarului cu unul nou sau curățarea și dezinfectarea capilarului înainte de următoarea utilizare, ceea ce mărește timpul total de colectare a hemolimfei. Sterilitatea hemolimfei poate fi, de asemenea, compromisă prin perforarea membranei care leagă segmentele abdomenului. Utilizarea AMHS elimină aceste probleme legate de capilare. În plus, colectarea hemolimfei prin decapitare poate contamina hemolimfa cu nectarul care se scurge din stomacul albinei. Noul nostru AMHS a dus la obținerea unor probe de hemolimfă de înaltă calitate biologică. Hemocitele au fost clar vizibile în fiecare probă de hemolimfă obținută prin AMHS (Fig. 1C). Analiza fiecărei lame de microscop a arătat că probele de hemolimfă obținute prin AMHS au fost pure și transparente, fără contaminare (de exemplu, grăunțe de polen).

Ne-am așteptat ca în realizarea AMHS, dezinfecția cu etanol și contactul limitat între picătura de hemolimfă și corpul albinei să asigure sterilitatea probei. Această așteptare a fost confirmată de testele microbiologice. Incubația hemolimfei dobândite prin AMHS pe mediile de agar MRS și Sabouraud a confirmat sterilitatea hemolimfei. Nu s-a observat nicio creștere a microorganismelor pe niciuna dintre cele 100 de picături de hemolimfă placate. Prin urmare, nu sunt prezentate aici rezultate cantitative. După terminarea perioadei de incubare, am observat doar cercuri maro închis de hemolimfă melanizată în jurul fiecărei picături. Această melanizare a avut loc în timpul perioadei de incubare, nu în timpul prelevării de probe (Fig. 1D și 1E). În special, atunci când hemolimfa colectată nu urmează să fie utilizată pentru teste microbiologice, etapa de dezinfecție poate fi omisă. Este posibil ca etanolul aplicat în zona antenelor să afecteze activitățile enzimatice sau hormonale.

Factorii, alții decât metodologia, pot influența eficiența colectării hemolimfei. În studiile noastre anterioare , am observat că cantitatea de hemolimfă colectată de la o albină depinde nu numai de casta și vârsta albinei, ci și de gradul de hidratare a acesteia, măsurat pe baza volumului de nectar sau sirop de zahăr consumat înainte de prelevarea hemolimfei. Ptaszyńska et al. raportează că prelevarea volumelor adecvate de hemolimfă este mai puțin eficientă de la albinele mai bătrâne. În plus, eficiența eșantionării poate depinde de abilitățile de laborator ale cercetătorului. Acești factori fac dificilă compararea caracteristicilor cantitative ale diferitelor protocoale de prelevare a hemolimfei între studiile efectuate în diferite laboratoare și utilizând diferite organisme. În special, în investigațiile noastre anterioare, am prelevat hemolimfa de la mii de albine folosind AMHS, precum și alte metode, inclusiv TCHS . Personalul laboratorului nostru are o experiență substanțială în colectarea hemolimfei de la albine de diferite vârste și caste. Această experiență ne-a ajutat să comparăm diferitele metode de prelevare a probelor, deoarece rezultatele noastre nu au fost afectate de erori datorate competențelor variabile ale personalului de laborator. Rezultatele noastre actuale au indicat că AMHS a fost o metodă eficientă, curată și foarte precisă (tabelul 1), care a necesitat mai puțin timp decât TCHS .

Prelevarea de probe de hemolimfă prin alte metode decât AMHS necesită, de obicei, echipament suplimentar, cum ar fi tuburi microcapilare. Mai mult, îndepărtarea hemolimfei din tuburile micro-capilare necesită fie utilizarea unei pompe speciale, fie zdrobirea tuburilor și centrifugarea lor cu ajutorul unor bile. Un alt avantaj al AMHS este posibilitatea de a utiliza un cântar de pipetă pentru a măsura volumul de hemolimfă colectat de la o singură albină. Acest lucru este deosebit de util atunci când se efectuează analize biochimice ale micro-eșantioanelor, de exemplu, pentru determinarea activităților enzimatice . Este demn de remarcat faptul că, atunci când se aplică alte metode decât AMHS , volumul hemolimfei pure poate fi calculat indirect, pe baza volumului de diluant hemolimfatic dintr-un tub înainte de prelevare și a volumului de diluant hemolimfatic măsurat după prelevare. Cu toate acestea, o astfel de metodă poate duce la erori suplimentare; prin urmare, unii cercetători utilizează seringi Hamilton . AMHS evită cheltuielile și munca suplimentară (de exemplu, decolmatarea seringii, dezinfectarea etc.) pe care le presupune utilizarea seringilor Hamilton.

Metoda Mayack și Naug (hemolimfa este obținută prin învârtirea albinelor cu antenele tăiate) este similară cu AMHS. Cu toate acestea, metoda lor necesită atât o centrifugă de laborator, cât și părțile bucale ale apienelor au trebuit să fie lipite pentru a preveni orice posibilă contaminare. În plus, în studiul lor, aceștia au disecat intestinele apienelor pentru a evalua infecția cu Nosema ceranae înainte de a roti albinele. Fără acest pas, intestinele ar fi fost o sursă probabilă de contaminare. Metoda lor implică plasarea albinelor în tuburi de centrifugare și centrifugarea lor la 16.000 RCF timp de 30 de secunde pentru a obține hemolimfa. Acest proces ar putea stratifica componentele hemolimfei (de exemplu, proteinele și hemocitele) și implică riscuri sporite de contaminare microbiologică și de melanizare a hemolimfei (a se vedea discuția de mai sus). Deși ar putea fi ideal pentru a analiza nivelurile de zahăr din hemolimfă în rândul albinelor furajere cu intestinele îndepărtate în prealabil (ca în studiul lor), nu este în întregime adecvat pentru studii microbiologice și genetice sau pentru investigații privind activitățile enzimatice. În acest context, noua noastră metodă AMHS este mai potrivită pentru o utilizare generală, fiind ușoară și simplă, și probabil aplicabilă într-o gamă largă de tipuri diferite de studii.

.