Abstract

Context. Detectarea precoce a bacteriemiei Gram-pozitive și terapia antimicrobiană adecvată în timp util sunt necesare pentru scăderea mortalității pacienților. Scopul studiului nostru a fost de a evalua performanța testului Verigene pentru hemocultura Gram-pozitivă (BC-GP) în două medii speciale de asistență medicală și de a determina impactul potențial al testării rapide a hemoculturilor pentru bacteremia Gram-pozitivă în cadrul sistemului japonez de furnizare a asistenței medicale. În plus, studiul a inclus hemoculturi simulate, care au inclus o bibliotecă de izolate de Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA) și enterococi rezistenți la vancomicină (VRE) bine caracterizate, reflectând diferite regiuni geografice din Japonia. Metode. Un total de 347 de teste BC-GP au fost efectuate pe culturi de sânge clinice și simulate. Rezultatele BC-GP au fost comparate cu rezultatele obținute prin metode de referință pentru identificarea genurilor/speciilor și detectarea genelor de rezistență utilizând metodologii moleculare și MALDI-TOF MS. Rezultate. Pentru identificarea și detectarea genelor de rezistență la două situri clinice și la hemoculturi simulate, concordanța generală a BC-GP cu metodele de referință a fost de 327/347 (94%). Timpul pentru identificarea și detectarea rezistenței antimicrobiene prin BC-GP a fost semnificativ mai scurt în comparație cu testele de rutină, în special la spitalul de cardiologie, care nu oferă servicii de microbiologie clinică la sfârșit de săptămână și în zilele de sărbătoare. Concluzii. BC-GP a generat o identificare precisă și detectarea markerilor de rezistență în comparație cu metodele de laborator de rutină pentru organismele Gram-pozitive în medii clinice specializate, oferind rezultate mai rapide decât testele de rutină actuale.

1. Introducere

Bacteriile Gram-pozitive sunt cele mai predominante microorganisme asociate cu sepsisul în mediile de îngrijire medicală și cea mai frecventă cauză de bacteriemie la pacienții cu transplant de celule stem hematopoietice . Bacteremia enterococică este asociată cu un risc crescut de mortalitate la pacienții cu transplant de celule stem hematopoietice, indiferent de sensibilitatea la vancomicină . În unitățile de cardiologie, endocardita infecțioasă, anevrismul infecțios, infecțiile sanguine legate de cateter sau infecțiile de la nivelul locului intervenției chirurgicale după operațiile cardiace sunt principalele infecții ale căror microorganisme cauzatoare cele mai frecvente sunt cocci Gram-pozitivi . În ambele unități medicale, detectarea precoce a markerilor Gram-pozitivi și a celor rezistenți este foarte importantă pentru gestionarea îngrijirii pacienților, administrarea antibioticelor și prevenirea răspândirii microorganismelor rezistente.

Deoarece intervenția precoce cu terapie antimicrobiană este asociată cu un prognostic îmbunătățit, fiecare oră de întârziere fiind asociată cu o mortalitate crescută, diagnosticul rapid este esențial . Testul Verigene Gram-positive blood culture (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) este un sistem de microarray de la probă la rezultat pentru identificarea bacteriilor Gram-pozitive comune și a markerilor principali de rezistență direct din hemocultura pozitivă. Deși un număr de studii au evaluat anterior performanțele BC-GP, raportând o concordanță de la 92 la 99% cu metodologia convențională , o limitare a rapoartelor anterioare a fost că multe dintre studii au fost din Statele Unite, precum și din țări din afara Japoniei, cu un singur raport publicat cu un domeniu de aplicare limitat în Japonia .

Variația genetică între liniile bacteriene care circulă în diferite regiuni geografice ale lumii poate afecta sensibilitatea testelor moleculare bazate pe sonde oligonucleotide pentru detectarea organismelor sau a markerilor de rezistență. Studiile din Hong Kong și Belgia au raportat performanțe mai scăzute ale BC-GP .

Scopul acestui studiu a fost acela de a determina impactul potențial asupra managementului pacientului și a rezultatelor pacientului al BC-GP în mediile spitalicești specializate din cadrul mediului medical japonez, care se confruntă cu o serie de provocări. O populație din ce în ce mai îmbătrânită și povara însoțitoare a creșterii costurilor generale ale asistenței medicale au pus la încercare infrastructura de asistență medicală. În ciuda faptului că Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA) reprezintă peste 90% din infecțiile nosocomiale cauzate de bacterii rezistente în Japonia , externalizarea testelor de microbiologie clinică sau lipsa acoperirii în weekend este comună în multe unități de sănătate ca parte a limitării costurilor. Această lucrare reprezintă prima evaluare cuprinzătoare a BC-GP în Japonia pentru a valida performanța sa clinică. Studiul de hemocultură simulată include o bibliotecă de tulpini de MRSA bine caracterizate asociate asistenței medicale (HA-MRSA), MRSA dobândite în comunitate (CA-MRSA) și enterococi rezistenți la vancomicină (VRE) care circulă în Japonia.

2. Metode

BC-GP a fost evaluat la Spitalul Toranomon (TH) și la Institutul Inimii Sakakibara (SHI), în conformitate cu protocoalele de studiu aprobate de consiliul de evaluare instituțională specifice locului, în perioada 26 iunie 2012 – 6 martie 2013. TH este un spital universitar general cu 1168 de paturi, cu o unitate de îngrijire hematologică cu 123 de paturi pentru transplant de celule stem hematopoietice care efectuează între 140 și 160 de transplanturi de celule stem hematopoietice pe an. Laboratorul de microbiologie din cadrul spitalului funcționează zilnic în timpul zilei. SHI este un spital universitar cu 320 de paturi, specializat în boli cardiovasculare, cu un număr de peste 1.500 de operații pe cord deschis pe an. Laboratorul de microbiologie din cadrul spitalului este operat de un laborator de referință comercial extern. Laboratorul de microbiologie funcționează în timpul schimbului de zi în zilele lucrătoare și este închis la sfârșit de săptămână și în zilele de sărbătoare.

Culturile de sânge au fost efectuate la SHI folosind flacoane BacT/ALERT FA și monitorizarea cu BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Franța). TH a utilizat flacoane BACTEC Plus și monitorizare cu BACTEC 9240 și FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, și NJ). În studiu a fost inclusă doar o singură sticlă de hemocultură pozitivă care conținea cocci sau bacili Gram-pozitivi per pacient. Doi ml de mediu de hemocultură pozitiv au fost depozitați la -85C pentru retestare.

Identificarea microbiologică de rutină și testele de sensibilitate ale izolatelor au fost efectuate cu ajutorul testelor de identificare convenționale, cum ar fi solubilitatea biliară, sensibilitatea discului optochin și sistemul MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) la TH și sistemul Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Franța) la SHI. Depistarea cefoxitinei pentru rezistența la meticilină a fost efectuată în conformitate cu orientările CLSI . S-a utilizat, de asemenea, un test de aglutinare cu latex pentru detectarea proteinei de legare a penicilinei PBP2a .

TestulBC-GP a fost efectuat pe hemocultura pozitivă care prezintă organisme Gram-pozitive, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, o probă bine amestecată de 350 μl din mediul de hemocultură a fost pipetată în godeul de probă al tăvii de extracție nucleică BC-GP, plasată pe Verigene Processor SP pentru procesare și analiză cu Verigene Reader.

A fost efectuată o evaluare pentru a determina diferența de timp dintre raportarea rezultatelor utilizând BC-GP și identificarea bazată pe cultură și rezultatele susceptibilității antimicrobiene pentru 139 de bulbi de hemocultură pozitivi. Pentru rezultatele bazate pe culturi, timpul necesar până la generarea raportului final a fost timpul dintre citirea colorației Gram și introducerea rezultatelor finale de identificare și susceptibilitate în sistemul informatic al laboratorului. Pentru BC-GP, timpul necesar până la obținerea rezultatului a fost timpul dintre citirea colorației Gram și introducerea rezultatelor BC-GP în sistemul informatic al laboratorului.

Un set de provocare de 208 hemoculturi simulate a fost construit folosind tulpini de tip, tulpini de referință și tulpini clinice din diferite regiuni geografice din Japonia pentru a evalua BC-GP. Tulpinile clinice au inclus organisme care au prezentat provocări pentru sistemele comerciale de identificare în studiile clinice anterioare la TH și SHI. În plus, a fost testată, de asemenea, o bibliotecă de tulpini HA-MRSA, CA-MRSA și VRE bine caracterizate din Japonia. Studiile cu hemoculturi simulate au fost efectuate la laboratorul medical Miroku (orașul Saku, prefectura Nagano, Japonia). Două sute opt tulpini au fost ajustate la o turbiditate de aproximativ 100 CFU/ml în soluție salină sterilă. Trei sute μl au fost inoculate în flacoane BACTEC Plus Aerobic/F care conțineau 8 până la 10 ml de sânge uman integral (grupa sanguină O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) pentru un inocul final de 30 CFU/ flacon. Un flacon BACTEC Plus Anaerobic/F a fost, de asemenea, inoculat pentru S. pneumoniae și grupul S. anginosus. Fiecare flacon a fost incubat în sistemul BACTEC până când a fost generat un semnal pozitiv. În cazul în care BC-GP a generat rezultate negative, s-a testat din nou diluția de 11 ori a mediului de hemocultură folosind apă distilată sterilă.

Care dintre izolatele de hemocultură pozitive de la cele două unități spitalicești a fost depozitat în lapte degresat 10% (Difco) la -85C. Identificarea speciilor a fost confirmată cu ajutorul spectrometriei de masă cu ionizare prin desorbție laser asistată de matrice în timp de zbor (MALDI-TOF MS) (Microflex LT cu Biotyper ver. 3.0 software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germania) pentru toate tulpinile . În cazul în care organismul nu a fost identificat la nivel de specie prin MALDI-TOF MS (valoarea scorului < 2,0) sau a fost identificat ca fiind Micrococcus, Listeria, Staphylococcus, altul decât S. aureus, Streptococcus, altul decât S. pyogenes, și S. agalactiae, la Universitatea Juntendo sau la Universitatea de Medicină a Femeilor din Tokyo s-a efectuat un test de confirmare prin secvențierea directă a PCR-ADNr 16S sau sodA . S-a efectuat o PCR specifică pentru detectarea mecA la toți stafilococii și vanA, vanB la toți enterococii . Metodele utilizate pentru tipizarea SCCmec a MRSA dobândite în comunitate sau asociate asistenței medicale utilizate pentru a caracteriza tulpinile au fost descrise anterior .

Concordanța a fost determinată prin comparație cu rezultatele metodelor de referință. A existat concordanță în cazul în care detectarea țintei BC-GP a fost în acord cu metoda de referință fie la nivel de gen, fie la nivel de specie. Au fost determinate intervalele de încredere de nouăzeci și cinci la sută (95% CI) și testul -pereche au fost determinate cu ajutorul GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Rezultate

În acest studiu, acordul global de identificare între BC-GP și metoda de referință a fost de 327/347 (94%) pentru hemoculturile prospective din două locații clinice și hemoculturile simulate. Acordul combinat între PCR și BC-GP pentru detectarea mecA a fost de 71/73 (97%) pentru hemoculturi prospective și hemoculturi simulate.

Acordul combinat de identificare din ambele unități spitalicești a fost de 129/139 (93%). Pentru culturile monomicrobiene, precizia de identificare a fost de 121/124 (98%). Acordul dintre PCR și BC-GP pentru pozitivitatea mecA a fost de 51/53 (96%). Tabelul 1 prezintă rezultatele din TH. În general, 96/104 (92%) organisme au fost identificate corect de BC-GP la nivel de specie sau gen, inclusiv detectarea genelor de rezistență. După cum se arată în tabelul 2, concordanța totală a BC-GP cu metoda de referință la SHI a fost de 33/35 (94%) organisme.

BC-GP raportează prezența mecA doar pentru S. aureus și S. epidermidis. În acest studiu, din cele 102 tulpini stafilococice, 72 au fost fie S. aureus, fie S. epidermidis. Rezultatele discordante s-au datorat organismelor S. epidermidis mecA nedetectabile în culturile polimicrobiene care conțineau atât S. epidermidis mecA pozitiv, cât ș i S. epidermidis mecA negativ. Dintre cele 30 de Staphylococcus spp. altele decât S. epidermidis și S. aureus, 21 (70 %) au fost pozitive pentru mecA, inclusiv 2 S. lugdunensis, care nu au putut fi raportate ca fiind mecA pozitive de către BC-GP.

Tabelul 3 arată diferența de timp dintre generarea rezultatelor BC-GP și identificarea finală pe bază de cultură și rezultatele susceptibilității antimicrobiene la ambele spitale. Rezultatele BC-GP au fost disponibile cu o medie de 28,2 până la 51,0 ore înainte de identificarea finală pe bază de cultură și de rezultatele de susceptibilitate la TH. La SHI, BC-GP a generat rezultate cu o medie de 34,5 până la 196,6 ore mai devreme. Comparând timpul necesar pentru obținerea rezultatelor finale de identificare și sensibilitate pe bază de cultură la TH și SHI, cu excepția lui S. aureus, rezultatele pentru S. epidermidis și stafilococi coagulazo-negativi, alții decât S. epidermidis, enterococi și streptococi au necesitat un timp semnificativ () mai lung la SHI (83,3, 123,6, 159,1 și 199,1 ore, respectiv) în comparație cu TH (40,8, 53,9, 36,1 și 53,5 ore, respectiv).

Utilizând hemoculturi Gram-pozitive simulate, BC-GP a identificat corect 198/208 (95%) dintre organisme (tabelul 4). Șase streptococi (3%) au fost fie identificați incorect, fie au fost identificați la nivel de gen doar de BC-GP. În ceea ce privește cele 4 flacoane de hemoculturi fals-negative BC-GP, 1 S. pyogenes a fost identificat corect și 1 S. mitis a generat un semnal pozitiv pentru genul Streptococcus/S. pneumoniae în urma unei diluții de 11 ori a mediului de hemocultură. Gena mecA a fost detectată în 20/20 (100%) organisme MRSA reprezentând tulpini dobândite în comunitate (SCCmec tip IIa, IV și V) și tulpini asociate asistenței medicale (SCCmec tip I, IIb, III și netipabile) prin BC-GP. BC-GP a detectat 14/14 (100%) gene vanA și 20/20 (100%) gene vanB în tulpini VRE bine caracterizate din studii anterioare din Japonia.

4. Discuții

Performanța BC-GP observată în studiul nostru a fost similară cu rapoartele anterioare . Deoarece serviciile de microbiologie clinică sunt externalizate sau nu funcționează în timpul turelor libere în timpul săptămânii și sunt închise la sfârșit de săptămână și de sărbători în multe spitale din Japonia, testele de diagnostic rapid au un potențial semnificativ de a avea un impact asupra îngrijirii pacienților prin scăderea dramatică a timpului de identificare a organismului și a rezultatelor susceptibilității antimicrobiene.

BC-GP detectează mecA la toți stafilococii pe baza măsurării intensității semnalului; cu toate acestea, raportarea este limitată la S. aureus și S. epidermidis pe baza unui algoritm în care mecA este raportat numai atunci când S. aureus sau S. epidermidis este detectat de BC-GP. Versiunile viitoare ale BC-GP ar trebui să ia în considerare modificarea algoritmului pentru a permite raportarea detecției mecA pentru stafilococi, alții decât S. aureus sau S. epidermidis, deoarece 70 % din cele 30 de tulpini care nu sunt S. aureus și S. epidermidis din studiul nostru erau rezistente la meticilină. Deși S. epidermidis este principalul agent patogen stafilococic coagulazo-negativ, alți stafilococi, cum ar fi S. lugdunensis și S. haemolyticus, sunt agenți patogeni importanți în mediul sanitar.

Culturile de sânge pozitive la polimicrobiene au generat cea mai mare parte a discordanței. În schimb, performanța BC-GP a fost de 121/124 (98%) în hemoculturile clinice monomicrobiene și de 198/208 (95%) în hemoculturile simulate. În acest studiu, hemoculturile polimicrobiene au reprezentat 14/106 (13%) și, respectiv, 3/33 (9%) din hemoculturile pozitive la TH și SH. Combinate, culturile polimicrobiene au reprezentat 17/139 (12%) din hemoculturile clinice prospective, ceea ce este în concordanță cu studiile anterioare care raportează că între 6 și 20% din toate infecțiile din sânge sunt polimicrobiene . BC-GP a identificat corect toate organismele în 12/17 (70%) de culturi polimicrobiene. În studiile anterioare BC-GP, ratele de identificare corectă în culturile polimicrobiene au variat între 57 și 86% . Deoarece informațiile înșelătoare pot afecta diagnosticul clinic, ducând la selectarea necorespunzătoare a agenților antimicrobieni, este necesar să se înțeleagă limitele BC-GP.

O preocupare suplimentară în cazul culturilor polimicrobiene este interpretarea clinică a detecției mecA și a detecției stafilococice. În cele 17 culturi polimicrobiene ale noastre, 5 probe au dat 2 sau 3 tulpini stafilococice cu sau fără mecA. Acest lucru poate duce la utilizarea inutilă a vancomicinei sau la subestimarea infecției cauzate de stafilococi rezistenți la meticilină. Repetarea BC-GP pe un alt set de hemoculturi poate diminua riscul acestei probleme. Pentru culturile monomicrobiene sau culturile simulate, toate discrepanțele au fost observate cu streptococi, cu excepția unei tulpini S. caprae. Greșelile de identificare BC-GP pentru streptococi au inclus 2 S. mitis identificate ca S. pneumoniae, nedetectarea a 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group și 2 S. pyogenes. Rapoartele anterioare au raportat, de asemenea, rezultate similare pentru S. mitis, S. oralis și S. pneumoniae . Deoarece înrudirea genetică între S. mitis, S. oralis și S. pneumoniae este bine cunoscută pe baza unei omologii >99% a secvențelor genei 16S ARNr , rezultatele BC-GP pentru S. pneumoniae sau Streptococcus cu alfa-hemoliză fără semnale pozitive specifice speciilor trebuie interpretate cu atenție și confirmate prin metode convenționale, cum ar fi sensibilitatea la optochin sau testul de solubilitate biliară. Este interesant faptul că o diluție de 11 ori a mediului original de hemocultură poate duce la detectarea semnalului Streptococcus și a semnalului de specie (tabelul 4). A fost raportată o gamă de detecție în funcție de organism prin BC-GP .

Beneficiul major al utilizării BC-GP este timpul mai scurt pentru raportarea identificării și a determinanților de rezistență din hemoculturile pozitive, ceea ce permite selectarea mai devreme a terapiei antimicrobiene adecvate și punerea în aplicare a măsurilor de control al infecției, cum ar fi izolarea și precauțiile de contact . Acest lucru are potențialul de a avea un impact semnificativ asupra sistemului japonez de furnizare a asistenței medicale. Diferența de timp dintre rezultatele BC-GP și rezultatele finale de identificare și de susceptibilitate bazate pe culturi, prezentate în tabelul 3 la TH, este în concordanță cu rapoartele anterioare . Pe de altă parte, rezultatele mai timpurii de 80,7 până la 196,6 ore pentru alte organisme decât S. aureus folosind BC-GP la SHI reflectă indisponibilitatea serviciilor de microbiologie clinică în timpul weekend-urilor și sărbătorilor. Având în vedere că serviciile de microbiologie clinică sunt externalizate în multe spitale din Japonia sau sunt limitate la un singur schimb în timpul săptămânii sau nu sunt oferite în timpul weekendurilor, beneficiile potențiale în termeni de costuri-beneficii ale menținerii serviciilor de hemocultură în spitale sunt semnificative. În plus, formarea personalului de laborator din laboratorul general pentru a recunoaște cocci și bacili Gram-pozitivi va permite testarea BC-GP în weekend, precum și seara/noaptea. BC-GP oferă spitalelor posibilitatea de a păstra în cadrul spitalului un serviciu de laborator foarte important.

În concluzie, BC-GP a oferit o identificare precisă și o detectare a markerilor de rezistență în comparație cu metodele de laborator bazate pe culturi de rutină pentru organismele Gram-pozitive, inclusiv tulpinile CA-MRSA, HA-MRSA și VRE care circulă în Japonia. Minimizarea timpului de optimizare a terapiei antimicrobiene cu ajutorul BC-GP poate contribui la reducerea costurilor și la îmbunătățirea îngrijirii pacienților. În 2016, BC-GP a primit aprobarea de reglementare în Japonia, devenind primul test molecular multițintă pentru hemoculturi pozitive aprobat ca dispozitiv de diagnostic in vitro pentru a ajuta la diagnosticarea infecțiilor bacteriene din sânge. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a valida raportul cost-eficiență al BC-GP în contextul sistemului japonez de furnizare a asistenței medicale.

Aprobare etică

Acest studiu a fost aprobat de comitetele interne de revizuire TH și SHI.

Interesele concurente

Toți autorii declară că nu au interese concurente.

Contribuțiile autorilor

Ken Kikuchi a conceput și a efectuat studiul și a redactat manuscrisul. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa și Reiko Yabusaki au efectuat lucrările de laborator. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka și Akiko Yoneyama au supravegheat colectarea datelor și au coordonat și participat la elaborarea studiului.

Recunoștințe

Acest studiu a fost sprijinit, în parte, de un Grant-in-Aid (S0991013) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei, Japonia (MEXT), pentru Fundația de Proiecte de Cercetare Strategică în Universități Private.

.